動脈粥樣硬化動物模型的研究進展

王鳳，章怡祎，劉萍

(上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院，上海 200032)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)嚴重危害人類生命健康，是導致人類死亡的“頭號殺手”。有關AS的確切病因尚不清楚。因此，國內外學者從不同側面提出諸多學說，如脂質浸潤學說、損傷-反應學說和炎癥學說等，但均不能全面解釋AS的發(fā)生與發(fā)展。鑒于AS是多因素共同作用的結果，對AS病因病機的探討、治療對策的探索和防治藥物的研發(fā)，成為醫(yī)學研究的重要課題。而展開此項研究的重要工具就是研究并建立可靠的AS動物模型。作者就各種模型的研究現(xiàn)狀及評價作一綜述，以期對深入研究和指導臨床能有所獲益。

1 AS模型的研究概況

1.1 AS模型動物的選擇

1.1.1 AS模型大鼠 AS模型大鼠應用較廣，是因其飼養(yǎng)方便、獲取簡易、生存能力強且手術耐受性好，但是其體形及動脈小，無膽囊，對外源性膽固醇吸收率低，具有抗實驗性AS特性等不利因素[1]。連偉光等[2]認為,HFJ大鼠AS模型特點更為顯著，可為AS研究提供一種新的實驗動物品系。

1.1.2 AS模型小鼠 利用小白鼠制造實驗模型取血不便、動態(tài)觀察較難，所以很少采用。隨著轉基因技術和基因敲除技術的出現(xiàn)，已成功研制出不少新的AS模型小鼠，如轉載脂蛋白E3(Leiden)基因小鼠模型和載脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠模型[3]，之后產生了目前應用最為廣泛的ApoE缺陷株(ApoE-/-)和LDL受體缺陷株(LDL-R-/-)模型小鼠。這類小鼠可自發(fā)形成動脈粥樣病變，如同時配合高脂飲食，能夠產生易損斑塊或形成血栓。

鼠模型的病變具有兩大優(yōu)勢：首先，病變的形態(tài)與人類產生的十分相似；其次，斑塊的破裂位置也與人類相似，同樣是發(fā)生在斑塊的肩部。然而，與人類不同的是，鼠模型的斑塊破裂處缺乏纖維蛋白和血栓形成。由此可見此類模型需要進一步改進，以更符合人類病變的特征。

1.1.3 AS模型兔 兔為最早用于復制AS模型的動物，主要有新西蘭家兔(NZW兔)、日本大耳白兔(JW兔)等。兔對外源性膽固醇吸收率高，對高血脂清除力低，采用多種方法聯(lián)合，易成模，且不同的飲食結構可產生不同類型的AS斑塊。此外，兔的體型大小非常適合制作動物模型，飼養(yǎng)方便，費用也能夠承受，至今仍然被廣泛應用。但是兔子是草食性動物，不易自發(fā)性產生AS，而且建模時的高脂飼養(yǎng)組方、喂飼方法、所用時間不同，使其病變特點亦與人體不同。同時，兔抵抗力差，易繼發(fā)感染而死亡，并且用藥量大，形成典型的AS病理學改變需8～12周[1]。另外，渡邊兔(WHHL兔)和圣·托馬斯兔是研究高膽固酵血癥和AS常用的兩個自發(fā)性動物模型。

1.1.4 AS模型小型豬 AS模型小型豬是現(xiàn)今較理想而且易得的研究AS的工具之一。雖然購買和飼養(yǎng)小型豬的費用較高，但是小型豬的飲食結構以及心血管系統(tǒng)在解剖、生理等方面近似于人類，即使在正常飲食時小型豬也會產生AS，且隨著飼養(yǎng)時間增長，還可自發(fā)產生AS[4]。

1.1.5 其它動脈粥樣硬化模型 除此之外，還有使用鴿、鵪鶉、犬、猴子等動物。如李潤琴等[5]使用高脂飼料喂養(yǎng)鵪鶉發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)動物動脈發(fā)生了粥樣變，出現(xiàn)典型的AS的病理形態(tài)學改變，故也較多用于抗AS藥物的評價。給予猴類高膽固醇飲食，可以發(fā)展成與人類相同的AS病變，但其價格昂貴，而且多是受保護的物種，因此，目前一般只限于AS復雜因素如精神壓力的研究[6]。對犬進行高膽固醇喂養(yǎng)通常不發(fā)生動脈硬化，因此較難模仿人類的AS狹窄模型[7]。

1.2 復制AS模型的概況

1.2.1 飼喂法 此法是AS研究中最常用的造模方法之一，已被眾多的研究者所接受。鑒于脂質代謝的差異，所用飼料是在基礎飼料、膽固醇、蛋黃、豬油的基礎上，根據實驗目的，采用不同配方組成。李然等[8]采用不同飼料結合L-蛋氨酸配方，研究大鼠高脂高同型半胱氨酸(HHcy)血癥模型。張璞璞等[9]研究采用高蛋氨酸飼料喂養(yǎng)結合球囊損傷腹主動脈的方法，建立了兔高同型半胱氨酸血癥及其所致AS模型。此外，還有采用高脂飼料結合丙基硫氧嘧啶(propylthiouracil，PTU)成功復制AS動物模型。PTU通過對甲狀腺功能的抑制，從而降低兔的新陳代謝，減少脂類消耗，促進脂類底物的利用，從而提高脂肪組織對甘油三酯的攝取能力。但PTU應用于AS模型大鼠復制中對大鼠心肌細胞產生較明顯的損傷，所以，對應用PTU有待進一步探討[10]。

1.2.2 灌胃法 王茁伉等[11]選用雄性日本大耳白兔，采用脂肪乳劑灌胃法(脂肪乳劑按膽固醇∶豬油∶蛋黃粉=1∶5∶4配制)加同步氮氣損傷(歷時5 min，150 ml·min-1氮氣流損傷血管內皮)，有效地建立了兔頸動脈粥樣硬化模型。連偉光等[2]采用高脂飲食、免疫損傷并結合維生素D3灌胃的方法，成功建立了HFJ大鼠和Wistar大鼠AS模型。吳楠等[12]采用維生素D3腹腔注射+高脂飼料(不含丙基硫氧嘧啶)+丙基硫氧嘧啶灌胃的方法，可建立典型的動脈粥樣硬化模型，與維生素D3腹腔注射+高脂飼料(含丙基硫氧嘧啶)進食組相比較，成模率高，死亡率低。

1.2.3 注射法 大量研究表明，人類動脈硬化的血管壁中含有大量的鈣，其含量與冠心病的病變程度呈正相關。Bennani-Kabchi等[13]發(fā)現(xiàn),維生素D3有利于損傷血管內皮細胞，促進血漿脂質及鈣對血管壁的侵入和沉積，促使血管鈣化，而血管的鈣化參與AS的產生和發(fā)展過程，從而加速AS形成?；诖朔N思路，周紅等[14]以大鼠為實驗對象，在高脂飼料喂養(yǎng)的基礎上，設計了3種維生素D3的不同給藥劑量，在不同的時間給予腹腔注射，誘導出的動物血脂水平都有增高，但誘導產生的血管病變不盡相同，以中劑量組建立了的模型較理想。

1.2.4 機械損傷法 現(xiàn)有文獻已報道了球囊法、輻射損傷法、空氣干燥法、下丘腦弓狀核損傷法、頸動脈內膜切除法等。王春田等[15]采用高脂飲食聯(lián)合球囊損傷動脈內膜的方法誘導大鼠腹主動脈粥樣硬化動物模型,結果證明該法具有可靠性強，可重復性高，更符合臨床動脈粥樣硬化疾病的發(fā)生發(fā)展過程等優(yōu)點。Cottin等[16]對兔經血管內192Irg輻射，并飼喂2%的高膽固醇飼料。2周時被輻射的動脈有局灶性的巨噬細胞內皮下黏附及內皮的損傷，6周時可觀察到血管內AS斑塊明顯增加。

1.2.5 免疫損傷法 AS的發(fā)病機制有免疫因素的存在，所以可以從免疫學的角度來探討AS模型，如使用牛血清白蛋白、卵清白蛋白、肺炎衣原體、EB病毒、巨細胞病毒、幽門螺桿菌、內毒素等進行免疫刺激，從而誘發(fā)AS的產生。

連偉光等[2]采用高脂飼料飼喂大鼠，并采用牛血清白蛋白(40 mg·kg-1)和卵清白蛋白(2.5 mg·kg-1)進行免疫損傷，并輔以維生素D3(25萬U·kg-1)灌胃，成功建立了HFJ大鼠動脈粥樣硬化疾病動物模型，可為動脈粥樣硬化研究提供一種新的實驗動物品系。劉劍剛等[17]采用高脂飼料結合經兔耳緣靜脈注射牛血清白蛋白的方法，導致兔AS斑塊形成和血脂水平、炎癥因子、血小板聚集及血管活性物質等經典指標的異常(有顯著相關性)，具有評價價值。曹佳超等[18]從不同角度報道了Cpn與AS的相關性。

1.2.6 基因改造法 各種基因敲除和轉基因小鼠是近年來的研究熱點之一。ApoE和LDL-R基因敲除鼠可自發(fā)形成動脈粥樣硬化斑塊，是動脈粥樣硬化研究的常用模型。在此基礎上應用基因打靶技術建立的白介素-1、C反應蛋白、清道夫受體、IgG Fc、補體C1q及CD44等模型,對研究動脈粥樣硬化中炎癥和免疫因子的作用機制起了重要作用[19]。近來成功報道的通過在受精卵中表達RNA干擾序列而建立的遺傳性基因敲除小鼠模型，技術應用成熟,可操作性強，時間上較基因敲除大為縮短[20]。但是由于基因改造小鼠體積小，臨床性檢查評估很難，與人類脂類代謝差異較大,尤其是某些在人體表達的脂蛋白代謝基因在小鼠體內卻不表達，如CETP等局限性，使得家兔模型在AS研究中價值凸現(xiàn)，如天然LDL受體缺陷的遺傳性高脂血癥WHHL兔，其表型比LDL受體基因敲除小鼠更接近人類疾病，曾經廣泛地用于高脂血癥的研究，但也有待進一步改造。繼續(xù)尋找更符合人類自身特點的AS模型依然是本研究領域的重要課題。

2 對AS模型的評價

動物模型是當代醫(yī)學研究中不可替代的一種重要工具，但模型只是模擬，而不是原型，它的建立方法的逐步改進，是基于人們對AS發(fā)病機制研究認識的不斷飛躍。無論哪一種As動物模型的建立，都是從AS的發(fā)病機制出發(fā)，基于不同的研究目的，采取不同的方法。如根據AS形成的脂質浸潤學說，采用高脂飼料喂養(yǎng)法;根據損傷-反應學說，采用機械損傷法;根據炎癥學說，采用免疫損傷法等。每種方法都有各自的優(yōu)點和缺點，如高脂飼養(yǎng)法優(yōu)點是接近人類飲食習慣，造成的模型較接近人類病變，缺點是沒有統(tǒng)一的飼料成分配比比例，可重復性較低，造模周期相對較長，模型成功率不高。機械損傷法建立模型快速并且AS的部位明確，缺點是手術要求極高，術后易感染等，對動物損害較大，造模成功率受到影響。免疫損傷法給我們了一個研究AS模型的新的方向，根據抗原抗體反應原理，來尋找AS的病因，此種方法制造的病變模型形成較快，易于制作，可以為使用疫苗防治AS的發(fā)生提供思路。但這只是起步階段，還有很多技術問題有待攻克，有很漫長的研究之路要走。

自1992年美國洛克菲勒大學生化遺傳與代謝實驗室和北卡羅萊那大學病理遺傳實驗室應用胚胎干細胞基因敲除(gene knockout)技術培育成ApoE基因敲除小鼠亦稱ApoE基因缺陷小鼠后，ApoE基因敲除小鼠也成為目前AS研究中應用最多的基因工程動物，因為它可以用于系統(tǒng)地研究某個基因或者某幾個基因和AS的關系，從基因水平闡釋病因病機，確定某一確切基因和發(fā)病的相關性，從而為從基因層面治療疾病提供理論依據，它使人類對于AS的認識登上了一個新臺階，促進了人類對AS的新探索。但是，此動物模型較局限，ApoE對AS作用機制還有待深入研究，另外還有一個很重要的缺陷需要注意，即基因改變以后，可能對動物體內細胞或代謝產生其他可知或不可知的影響，從而可能干擾實驗結果以及增加對實驗結果分析的難度，而且操作技術要求很高，實驗設備要求精良，鑒于目前我國國情，還很難在全國廣泛推廣使用。

根據多數(shù)學者認可的鈣超載機制，在高脂飼料喂養(yǎng)的同時，選用大劑量的維生素D3，無論是采取腹腔注射的方法，還是實施灌胃法，均可在較短時間內導致動物血鈣明顯升高，誘發(fā)動脈管壁損傷和硬化，形成明顯的斑塊，這是一種用維生素D3快速誘導AS模型的方法優(yōu)點;而其缺點是導致了動物食欲減退，食量有所下降，體質量也繼而下降，多器官功能異常，甚至死亡率增加。

單一方法制作的動物模型是絕對不能如實準確代表動脈粥樣硬化的發(fā)病本質。由于AS是在多種遺傳及環(huán)境因素參與下發(fā)病，是由多個重要功能基因異常、血脂代謝異常及炎癥反應和免疫因子等互相聯(lián)系難以分割的多因素共同作用下的一個緩慢復雜的過程，加上動物本身的生理特點及動物與人的種屬差異，導致無論哪種方法，都不能翔實全面地復制出人類AS的病理變化和過程。所以在實際運用中，多以高脂飼養(yǎng)為基礎，同時疊加各種損傷因素和致炎、致免疫反應因子的破壞作用，以加速血管內皮損傷，加速AS的形成。也只有采用多種方法聯(lián)合，以摸索出更接近動脈粥樣硬化本質，才能為建立操作簡便、可靠、可重復的AS動物模型，提供可借鑒的思路,從而為AS診斷、防治及治療藥物的研發(fā)創(chuàng)造更好的基礎條件。

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