椎間盤細(xì)胞老化信號通路及檢測方法的研究進(jìn)展

史航，吳小濤

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 骨科，江蘇 南京 210009)

椎間盤位于兩個相鄰的椎體之間，起連接作用，對人體的運(yùn)動、穩(wěn)定、平衡等有著重要的生物學(xué)意義。目前，椎間盤退行性病變的患病率顯著增加，它是一種與年齡相關(guān)的疾病，引起退變的因素有很多，其共同特點(diǎn)是髓核細(xì)胞(nucleus pulposus chondrocyte，NPC)數(shù)量減少和功能減退、細(xì)胞外基質(zhì)含量下降且比例失調(diào),這些都涉及到椎間盤細(xì)胞老化或凋亡。椎間盤細(xì)胞的老化和凋亡是組織退變過程中非常關(guān)鍵的因素[1]。通過對椎間盤退變的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤退行性改變是從髓核細(xì)胞衰老開始，并進(jìn)行程序性退變的過程[2]。

1 椎間盤細(xì)胞的老化現(xiàn)象

20世紀(jì)60年代初，Hayflick等[3]在體外培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞連續(xù)分裂幾次后即失去增殖能力，他們將這一特殊的細(xì)胞生命活動狀態(tài)命名為細(xì)胞老化(senescence)。細(xì)胞發(fā)生老化時，仍具有一定的代謝活性，可分泌合成多種基質(zhì)，但分泌表型已發(fā)生改變，細(xì)胞永久地停滯在G1期，無法進(jìn)行有絲分裂而增殖。研究表明，大量老化細(xì)胞的集聚將會導(dǎo)致組織器官內(nèi)功能細(xì)胞數(shù)目的減少及活性的降低，從而引起一系列如骨關(guān)節(jié)炎、皮膚衰老等退行性疾病，椎間盤的退行性變也不除外[4-5]。Evans等[6]研究發(fā)現(xiàn)，退變的椎間盤內(nèi)存在細(xì)胞老化現(xiàn)象。Kim等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在椎間盤退行性變中，隨著年齡的增長，老化髓核細(xì)胞的數(shù)量逐漸增加，端粒酶活性降低，端粒的長度也隨之縮短。Roberts等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在突出的椎間盤組織中β-半乳糖苷酶(senescence associatedβ-galactosidase，SA-β-gal)陽性細(xì)胞數(shù)目增多，而且髓核細(xì)胞的陽性率比纖維環(huán)細(xì)胞的要高。Gruber等[9-10]研究發(fā)現(xiàn)，隨著椎間盤退變程度(按Thompson分級)的加重，SA-β-gal陽性率顯著增加。

2 細(xì)胞老化機(jī)制及椎間盤細(xì)胞老化的信號通路

2.1 細(xì)胞老化機(jī)制

細(xì)胞老化是指體細(xì)胞在受到各種內(nèi)外環(huán)境因素刺激下，復(fù)制一定次數(shù)后失去了分裂增殖能力，功能減退，不可逆地停滯在G1/S期，進(jìn)入無法增殖的狀態(tài)[11]。細(xì)胞老化的一個重要機(jī)制是細(xì)胞連續(xù)性分裂后，染色體端粒進(jìn)行性縮短和端粒功能異常，后者模擬DNA損傷信號，上調(diào)p53基因表達(dá)，隨后p53會激活其下游基因p21，從而抑制CDK2-Cyclin E的活性，降低了視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)蛋白的磷酸化程度，進(jìn)而失活主要負(fù)責(zé)細(xì)胞周期遞進(jìn)的核轉(zhuǎn)錄因子E2F，形成了由p53-p21-pRB信號介導(dǎo)的復(fù)制性老化(replicative senescence，RS)[12-13]。此外，在某些應(yīng)激因素(如異常應(yīng)力、氧化應(yīng)激、營養(yǎng)障礙等)刺激下，細(xì)胞在尚未經(jīng)歷過多的有絲分裂且維持一定端粒長度情況下能使p16表達(dá)上調(diào)，后者通過取代細(xì)胞周期蛋白Cyclin D與CDK4/6結(jié)合，使Cyclin D-CDK4/6活性受到抑制，從而使pRB處于去磷酸化狀態(tài)而減少轉(zhuǎn)錄因子E2F的釋放，進(jìn)而阻止DNA的合成，使細(xì)胞停滯在G1/S期，從而阻礙了細(xì)胞的分裂增殖，最終形成了由p16-pRB信號介導(dǎo)的應(yīng)激誘導(dǎo)的過早老化(stress induced premature senescence，SIPS)[14-15]。

目前認(rèn)為，細(xì)胞老化的p53-p21-pRB與p16-pRB兩條信號通路之間存在著廣泛的重疊效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使p16基因表達(dá)沉默后，細(xì)胞在某些應(yīng)激環(huán)境下同樣可發(fā)生過早老化，說明p53-p21-pRB信號通路也參與應(yīng)激誘導(dǎo)的過早老化的發(fā)生[16-17]。此外，p16的同源蛋白p14對p53具有調(diào)節(jié)作用，p14可通過一系列反應(yīng)抑制p53的降解，從而維持p53蛋白的穩(wěn)定與活性[18]。Han等[19]在人類成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，p16能增加p21蛋白的穩(wěn)定性，p21則通過轉(zhuǎn)錄因子Sp1而激活p16的基因表達(dá)，協(xié)同抑制細(xì)胞周期。

2.2 椎間盤細(xì)胞老化的信號通路

椎間盤是人體最大的缺血器官，在承受應(yīng)力負(fù)荷的同時，其內(nèi)的髓核細(xì)胞尚面臨著缺血缺氧、營養(yǎng)匱乏等不利環(huán)境。研究[6，9-10]顯示,在上述椎間盤環(huán)境的作用下，約30%的髓核細(xì)胞逐漸發(fā)生老化，且老化細(xì)胞所占比例隨椎間盤退變程度的加重而增大。Kim等[7]通過對人類椎間盤退變機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，在衰老的髓核細(xì)胞中均表達(dá)p53、p21和pRB，而且端粒進(jìn)行性縮短，端粒酶活性降低。Liang等[20]研究證實(shí)，將端粒酶基因轉(zhuǎn)入髓核細(xì)胞內(nèi)，端粒酶活性明顯增強(qiáng)，其調(diào)節(jié)的p53表達(dá)水平降低。以上研究均提示由p53-p21-pRB信號通路介導(dǎo)的髓核細(xì)胞復(fù)制性老化在椎間盤退行性變過程中起著重要的作用。

然而，Dang等[21]研究發(fā)現(xiàn)青少年甚至兒童也會發(fā)生椎間盤退行性改變。Le Maitre等[1]研究發(fā)現(xiàn)，在青少年退變的椎間盤中，老化的椎間盤細(xì)胞與年齡、端粒長度無明顯的相關(guān)性，而與p16的高表達(dá)有關(guān)。說明p16-pRB信號通路介導(dǎo)的應(yīng)激誘導(dǎo)的過早老化亦存在于椎間盤退變過程中。

3 細(xì)胞老化的基本特征及檢測方法

3.1 細(xì)胞周期停滯

細(xì)胞周期停滯是細(xì)胞老化的一個基本特征，也是用于體外鑒定細(xì)胞老化的一個重要指標(biāo)[22]。為了檢測細(xì)胞是否躍出了細(xì)胞周期，人們通常檢測增殖相關(guān)提示因子Ki-67的表達(dá)程度；或者通過將溴脫氧尿嘧啶摻入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，觀察是否合成新的DNA。通過流式細(xì)胞術(shù)可以觀察到細(xì)胞群中處于不同周期細(xì)胞的比例：細(xì)胞老化主要表現(xiàn)為G1期阻滯，但也可以伴隨G2/M期阻滯或者直接由G2/M期阻滯誘導(dǎo)形成[23-24]。

3.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

雖然細(xì)胞周期阻滯，DNA停止了復(fù)制，但老化細(xì)胞中RNA與蛋白質(zhì)含量均比正常細(xì)胞中明顯增多[25]。這是因?yàn)殡m然細(xì)胞進(jìn)入老化階段后，蛋白質(zhì)的整體合成能力下降，但是蛋白質(zhì)的降解體系受到更加明顯的抑制，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)累積。同樣的情況應(yīng)該也發(fā)生在RNA的合成和分解過程中。這種生物大分子的積累使老化細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，如老化髓核細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大、胞質(zhì)變脆、胞漿空泡化明顯。然而，并不是所有的細(xì)胞老化都會出現(xiàn)上述所有類型的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。例如，在一些由于基因突變或表達(dá)異常導(dǎo)致的細(xì)胞老化中，其細(xì)胞形態(tài)改變就不典型[22]。

3.3 老化相關(guān)β-半乳糖苷酶染色

通過細(xì)胞形態(tài)判定細(xì)胞老化存在主觀性，檢測細(xì)胞周期停滯缺乏直觀性，往往很難在組織中直接觀察到老化細(xì)胞。而與老化相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色為檢測細(xì)胞老化提供了一種新的方法[26]。β-半乳糖苷酶主要存在于溶酶體內(nèi)，該酶在pH 4.2～pH 4.6的條件下活性最高，在中性條件下檢測不到其活性。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生老化時，溶酶體膨脹、數(shù)目增多，β-半乳糖苷酶在溶酶體中明顯累積，從而保證了即使在pH 6的條件下依然可以檢測到該酶的殘余活性[26-27]。因此,人們將在pH 6時仍可檢測到活性的β-半乳糖苷酶稱為SA-β-gal。然而，β-半乳糖苷酶的活性上調(diào)也可在一些非老化的腫瘤或永生化細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)，目前仍缺乏能特異性反映細(xì)胞老化狀態(tài)的生化指標(biāo)。盡管如此，因?yàn)槠涿舾行?、特異性等?yōu)勢，SA-β-gal染色仍然是目前檢測細(xì)胞老化的多種方法中應(yīng)用最廣泛的一種方法。

3.4 老化相關(guān)異染色質(zhì)集落(senescence associated heterochromatin foci，SAHF)形成

SAHF形成是描述細(xì)胞老化狀態(tài)的一項(xiàng)特異指標(biāo)，它的主要表現(xiàn)是常染色質(zhì)DNA凝集，并形成致密、大小不等的異染色質(zhì)顆粒[28-29]，而每一個異染色質(zhì)顆粒大多來自一條單獨(dú)的染色體[30-31]。SAHF在不可逆的細(xì)胞周期停滯中發(fā)揮著重要作用[28]。在SAHF中，H3型組蛋白(histone H3)第9位賴氨酸(H3K9)三甲基化水平明顯增加，并以此為錨定點(diǎn)來吸引各亞型異染色質(zhì)蛋白1(heterochromatin protein 1，HP1)聚集[30]；同時會出現(xiàn)染色質(zhì)上H1型組蛋白(histone H1)的剝離和高遷移率A族蛋白(high-mobility group A proteins，HMGA proteins)、非經(jīng)典組蛋白macroH2A的沉積[29，31-32]?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為，SAHF是在p16-pRB通路和以組蛋白抑制蛋白A(histone repressor A，HIRA)為核心的組蛋白分子伴侶復(fù)合物協(xié)同作用下形成的[33]。當(dāng)p16表達(dá)水平上調(diào)時，E2F的轉(zhuǎn)錄因子活性受到明顯抑制，結(jié)合在E2F靶標(biāo)基因上的組蛋白甲基化水平隨之升高，從而為HP1的結(jié)合以及SAHF的形成提供了靶點(diǎn)[33-34]。由于SAHF的特征性結(jié)構(gòu)，近年來它已經(jīng)作為新的標(biāo)志物用于判定細(xì)胞老化。

3.5 端粒功能異常

端粒是位于染色體末端的DNA重復(fù)序列，是由短的多重復(fù)的非轉(zhuǎn)錄序列(TTAGGG)及一些結(jié)合蛋白組成的特殊結(jié)構(gòu)，它能保護(hù)染色體末端免于融合和退化，在染色體定位、復(fù)制、保護(hù)和調(diào)控細(xì)胞生長等方面具有重要作用[35]。然而，由于DNA聚合酶無法完全復(fù)制染色體的滯后鏈，導(dǎo)致端粒DNA重復(fù)序列隨著復(fù)制次數(shù)的增加而不斷縮短，當(dāng)端?？s短到一定程度時，細(xì)胞便會開啟自發(fā)性老化程序[36]。人們可以通過檢測端粒序列的長度和端粒逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)的酶活性來評估端粒的功能。因而，端粒功能異常也被認(rèn)為是一種可作為評判細(xì)胞老化的潛在標(biāo)志物。

4 小結(jié)與展望

隨著椎間盤退變的進(jìn)行性加重，老化的髓核細(xì)胞在體內(nèi)不斷聚集，為了進(jìn)一步了解椎間盤細(xì)胞老化在椎間盤退變中的機(jī)制，將來的研究可采用人正常髓核細(xì)胞系，通過體外連續(xù)培養(yǎng)傳代、氧化應(yīng)激干預(yù)分別建立髓核細(xì)胞復(fù)制性老化和應(yīng)激誘導(dǎo)的過早老化模型，探索p53-p21-pRB和p16-pRB通路在髓核細(xì)胞老化過程中的信號介導(dǎo)與交通，尋找髓核細(xì)胞老化的關(guān)鍵調(diào)控信號及老化過程中特異性的標(biāo)志物，為生物學(xué)治療更具針對性地選擇抗老化靶點(diǎn)來修復(fù)椎間盤退變打開嶄新思路。

目前廣泛應(yīng)用判定細(xì)胞老化基本特征的方法有細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、SA-β-gal染色、SAHF形成、端粒功能異常等。我們認(rèn)為，目前尚無任何一種可以在體內(nèi)外單獨(dú)、可靠地鑒定細(xì)胞老化的有效方法，在缺乏老化特異性檢測指標(biāo)的情況下，上述多種方法的聯(lián)合應(yīng)用是評價細(xì)胞老化的較好選擇。

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