前列腺癌動物模型的研究進展

黃燁清，陳明

(東南大學醫(yī)學院，江蘇 南京 210009)

前列腺癌在男性惡性腫瘤中發(fā)病率位居第2位，死亡率位居第6位[1]。據(jù)美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計，2012年美國約有241 740例新發(fā)前列腺癌，有28 170例死于此病[2]。據(jù)2012年我國腫瘤協(xié)會統(tǒng)計，全國前列腺癌的發(fā)病率為9.92/10萬[3]。隨著蛋白質(zhì)及基因芯片技術(shù)應(yīng)用于輔助臨床診斷，比如P504/AMACR等癌相關(guān)基因的檢測[4]等，使得前列腺的診斷手段不斷提高和多元化。而前列腺癌動物模型是我們進一步研究前列腺癌的發(fā)病機制、腫瘤與宿主關(guān)系、腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移機制以及評價治療效果的一個有力的工具。目前已經(jīng)建立的前列腺癌動物模型，以腫瘤來源形式分類，可分為自發(fā)性腫瘤模型、誘發(fā)性腫瘤模型、轉(zhuǎn)基因腫瘤模型和種植性腫瘤模型。

1 前列腺癌的自發(fā)模型

自發(fā)性腫瘤模型是指在不經(jīng)過有意識的人工干預處理而自然發(fā)生的一類腫瘤模型。其優(yōu)點在腫瘤發(fā)生模擬了相對自然狀態(tài)下動物前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。犬類是動物中唯一能夠發(fā)生前列腺上皮內(nèi)腫瘤性增生(PIN)和前列腺癌的動物[5]。自發(fā)性犬類前列腺癌模型具有高齡易發(fā)生、易于轉(zhuǎn)移及晚期易發(fā)生激素非依賴性轉(zhuǎn)化，并且有癌灶向骨盆及脊柱進行骨轉(zhuǎn)移的優(yōu)點，同時患癌犬會出現(xiàn)腰椎疼痛和神經(jīng)功能障礙有關(guān)聯(lián)的癥狀。但缺點相對明顯，犬類由于自身體積及脾性原因等，實驗較難控制，并且化學誘導癌發(fā)生率受藥品濃度等多因素影響，且腫瘤模型發(fā)生耗時長，模型建立耗費量大等，不能較好地適應(yīng)研究的需要，因而其應(yīng)用受到限制。

2 誘發(fā)性腫瘤模型

常用的化學致癌誘導劑主要有DMAB(3，2′-二甲基4-氨基聯(lián)苯)[6]和MNU(氮甲基亞硝基尿素)等。激素類誘導劑包括雄激素聯(lián)合雌二醇誘導和睪酮聯(lián)合β雌二醇。其中，化學致癌劑MNU和DMAB與長效睪酮誘導的F344大鼠前列腺癌模型的發(fā)病率較高，且通過解剖發(fā)現(xiàn)腫瘤起源于背側(cè)葉及中葉，此模型與人前列腺癌有相似的生物學行為和特點,可通過血行、淋巴轉(zhuǎn)移，組織分化特點與人類相似。因此，化學致癌劑聯(lián)合長效睪酮誘導前列腺癌動物模型是相對理想的版本。

3 種植性腫瘤模型

前列腺癌種植模型從種植的部位分，可以分為皮下種植、血管內(nèi)接種種植、腹腔內(nèi)種植、靶器官原位種植、腎包膜下種植以及骨骼種植。按腫瘤種植來源分，分為同種種植及異種種植，其中后者較常采用。常用的人前列腺癌細胞系有LNCaP、PC-3、DU-145、CWR22Rv1等。裸鼠因其自身免疫缺陷特性成為了建立人類前列腺癌動物模型的最佳載體，將人類癌細胞通過注射、外科種植等手段接種至裸鼠體內(nèi)是較常規(guī)的模型建立方法。

3.1 皮下種瘤

皮下成瘤的操作簡易，對實驗室硬件要求相對一般。趙林等[7]報道，通過皮下注射4種前列腺癌細胞DU145、Tsu、PC3和LNCaP，成功制作出荷瘤裸鼠。據(jù)報道LNCaP皮下成瘤后，裸鼠血清PSA受裸鼠雄激素水平及瘤體大小影響。將裸鼠行去勢手術(shù)后，裸鼠PSA下降達80%，并持續(xù)4周。隨后裸鼠PSA水平逐漸上升至閹割前水平。研究結(jié)果提示，前列腺癌有激素依賴性向激素非依賴性的轉(zhuǎn)化，與人類前列腺癌的發(fā)病及激素依賴性轉(zhuǎn)變的特點有相似之處。Hara等[8]通過皮下注射LNCaP細胞懸液至去勢雄性裸鼠，并用比卡魯胺連續(xù)飼養(yǎng)裸鼠，首次成功地模擬了臨床的“抗雄激素藥撤退綜合征”現(xiàn)象，為研究晚期前列腺的進展，比如前列腺癌的激素依賴性的轉(zhuǎn)變提供了良好的實驗平臺。

3.2 原位種瘤

外科原位移植瘤技術(shù)建立的前列腺癌模型，較好地保留了腫瘤細胞的生物學習性，有著生長快、局部侵犯范圍較廣且較高的淋巴轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移率等特點，是較為理想的前列腺癌移植模型。

3.2.1 原位注射成瘤 即解剖暴露膀胱、前列腺及精囊腺，以癌細胞懸液行前列腺被膜下注射，至薄膜鼓起脫離前列腺表面為準[9]。原位注射后模型裸鼠尸檢發(fā)現(xiàn)，膀胱、精囊腺、前列腺及腸管黏連，不能排除局部癌細胞因注射操作引起的誤差。原位注射種瘤技術(shù)中最關(guān)鍵步驟在于解剖暴露膀胱，注射癌細胞時可以加入matrigel膠提高成瘤率。

3.2.2 外科原位種瘤術(shù) Bobek等[10]在多次試驗后對原位種植技術(shù)進行了改進，將前列腺癌細胞接種至裸鼠皮下形成瘤體，再將瘤體取出，分切成1 mm3等體積小塊，種植背側(cè)葉，即組織重組技術(shù)。然而此方法對操作者技術(shù)、實驗室硬件條件要求較高，并且操作者須進行專業(yè)的訓練和反復的練習。

王元天等[11]通過PC-3細胞皮下注射8周后成瘤，取出并修剪小體積后，移植至裸鼠前列腺背側(cè)葉被膜下。9～12周后處死裸鼠。結(jié)果顯示，90%(18/20)的裸鼠前列腺種植成功；85%(17/20)的瘤組織直徑大于1.5 cm；60%(12/20)出現(xiàn)膀胱擴張及腎積水；50%(10/20)出現(xiàn)腹膜后主動脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；20%(4/20)發(fā)生肺轉(zhuǎn)移；5%(1/20)發(fā)生肺轉(zhuǎn)移；骨轉(zhuǎn)移率為0。此實驗成功地應(yīng)用激素非依賴性PC-3細胞系制成前列腺癌原位模型，但實驗中肺轉(zhuǎn)移和主動脈旁淋巴轉(zhuǎn)移的發(fā)生早于骨轉(zhuǎn)移，這與人類前列腺癌轉(zhuǎn)移特點有較大差異。此實驗雖然成功建立裸鼠前列腺癌模型，但是不能成為前列腺癌骨轉(zhuǎn)移研究的良好模型。

3.3 腎包膜下種植

據(jù)van Weerden等[12]報道，腎包膜下種植人類前列腺癌細胞或組織，瘤體同樣能獲得良好的生長，且其種植成瘤率均優(yōu)于原位注射種植及皮下種瘤。另外，Wang等[13]通過外科手段將人類來源前列腺癌組織種植至裸鼠腎臟薄膜下，發(fā)現(xiàn)種植的癌組織在局部生長后組織形態(tài)及免疫組化特性不會受到影響。

孫宏斌[14]采用SVM(小鼠精囊間質(zhì))與人類前列腺癌組織在鼠尾膠原中體外重組后，借助微創(chuàng)外科技術(shù)將重組體與單純癌組織種植于裸鼠雙側(cè)腎臟包膜下，并且在裸鼠頸部種植睪酮硅膠囊。4周后對裸鼠進行尸檢，觀察到重組種瘤成功率為100%，而癌組織種瘤成功率為94.1%。肉眼下觀重組種植瘤體生長旺盛，重組種瘤方式得到的瘤體體積及重量均優(yōu)于單純種瘤組。前者血清PSA值高于后者。通過這種頸部皮下包埋睪酮硅膠囊的方法可以避免動物體激素水平的差異帶來的誤差。在低分化腫瘤種植組中，觀察件SVM向腫瘤間質(zhì)中侵襲生長，由此可見前列腺癌細胞對正常SVM基質(zhì)生物學特性產(chǎn)生了影響。

3.4 移植骨種植模型

移植骨轉(zhuǎn)移模型案例較少。Tsingotjidou等[15]報道了通過篩選撿取全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后的骨片，種植于裸鼠后肢皮下，4周后以PC-3和LAPC-4細胞注射至種植骨旁，8至12周進行裸鼠尸檢，發(fā)現(xiàn)兩種細胞系都能引起局部的破骨細胞聚集及活躍的破骨細胞活動。此方法是人類前列腺癌細胞對人類骨骼侵襲的模型，完全避開了物種差異性帶來的誤差。

3.5 血管內(nèi)接種模型

這類動物模型是通過在血管內(nèi)注射前列腺癌細胞懸液，通過血運將前列腺癌細胞送達全身各處器官停留并引起種植。目前主要有尾靜脈注射、左心室注射和腔靜脈注射等3種方法。

3.5.1 經(jīng)裸鼠尾靜脈注射 Shevrin等[16]通過PC-3細胞懸液形式注射至裸鼠尾靜脈，88%(14/16)的裸鼠發(fā)生了肺轉(zhuǎn)移，無裸鼠發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。改進方法，夾閉下腔靜脈后從尾靜脈注射，使癌細胞不能直接沿下腔靜脈回流至肺動脈，而是經(jīng)椎骨靜脈途徑回流，結(jié)果19%(3/16)發(fā)生椎骨轉(zhuǎn)移，而肺轉(zhuǎn)移率降低至31%(5/16)。單純尾靜脈注射能夠獲得較高的肺轉(zhuǎn)移率及較低的骨轉(zhuǎn)移率，與人前列腺癌轉(zhuǎn)移路徑大相庭徑,但單純尾靜脈注射癌細胞可以從一個側(cè)面反映癌細胞通過對靶器官種植能力。

3.5.2 左心室注射模型 Angelucci等[17]報道,PC-3細胞懸液通過左心室注射到裸鼠體內(nèi)40 d后應(yīng)用X光檢查發(fā)現(xiàn),64%的裸鼠發(fā)生了腰椎的骨轉(zhuǎn)移及活躍的溶骨性改變;同時，Angelucci應(yīng)用此方法從模型體內(nèi)篩選出高轉(zhuǎn)移性亞系PCb2。Tennant等[18]報道，左心室內(nèi)注射在2～3周后即可發(fā)現(xiàn)腰椎骨轉(zhuǎn)移引發(fā)病理性骨折。左心室注射骨轉(zhuǎn)移模型，操作上較尾靜脈復雜，但可為研究前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移的病理生理過程提供了一種良好的動物模型。

3.5.3 腔靜脈注射模型 單純腔靜脈注射腫瘤偶見報道，因其注射途徑無法避開回流至肺動脈，所以癌細胞的種植途徑與尾靜脈注射相類似。

3.6 骨轉(zhuǎn)移模型

Fisher等[19]通過脛骨髓腔注射PC-3、Du145和LNCaP細胞懸液，試圖建立骨轉(zhuǎn)移模型，結(jié)果PC-3組成瘤率為78%(7/9)，Du145組為100%(9/9)，而LNCaP組無骨轉(zhuǎn)移灶形成(0/9)。病理檢查顯示，Du145組與PC-3組的骨轉(zhuǎn)移灶呈成骨反應(yīng)與溶骨反應(yīng)混合型改變。Andresen等[20]應(yīng)用CWR22Rv1細胞系同樣行脛骨髓腔注射，也成功制成前列腺骨轉(zhuǎn)移模型，且在8周后通過微型核素骨掃描得到了客觀脛骨骨質(zhì)破壞的照片證據(jù)。脛骨髓腔注射種瘤，具有種瘤效率高，操作相對簡易，不受臟器轉(zhuǎn)移干擾等優(yōu)點，但骨轉(zhuǎn)移骨破壞模型多發(fā)生在骨干部，與臨床常見的骨骺端轉(zhuǎn)移不同，但從相關(guān)的骨質(zhì)破壞影像及組織病理學檢查結(jié)果來看，其與臨床骨轉(zhuǎn)移引起骨質(zhì)破壞狀況相似，因此成為廣泛采用的前列腺癌骨轉(zhuǎn)移模型。

4 基因修飾模型

基因修飾模型主要有轉(zhuǎn)基因模型和基因敲除模型兩類。

4.1 基因敲除模型

指利用外用性DNA與受體細胞染色體DNA進行重組，使之整合到預定靶點，并替代原有基因從而改變細胞遺傳特性的方法。目前人們已經(jīng)建立敲除特異性的抑癌基因，如Pten/Mmacl和Mxi1的模型、敲除高度保守的同源框基因NKx3.1制作的模型[21-22]。

4.2 轉(zhuǎn)基因模型

SV40病毒產(chǎn)生的腫瘤蛋白可阻斷抑癌基因P53與Rb的信號作用通路，從而引起前列腺癌性突變。Gingrich等[23]通過SV40攜帶probasin蛋白的啟動子的一個片段轉(zhuǎn)入小鼠受精卵細胞中，成功培育成TGAMP小鼠前列腺癌模型。通過后續(xù)觀測等發(fā)現(xiàn),當TGAMP模型在10～20周齡時，100%的小鼠發(fā)生了局灶性前列腺癌，大多數(shù)腫瘤位于背側(cè)葉，并且表現(xiàn)出前列腺癌侵襲與轉(zhuǎn)移相應(yīng)的演進過程。目前，TGAMP小鼠前列腺模型正被應(yīng)用于前列腺癌去勢治療后病程的模擬過程、胰島素樣生長因子軸與前列腺癌進展的關(guān)系等。

以SV40-T為載體建立的轉(zhuǎn)基因小鼠可演進為具有較強侵襲能力的前列腺癌，且有神經(jīng)內(nèi)分泌功能等，在研究前列腺癌神經(jīng)內(nèi)分泌功能方面起到了幫助。除此以外，Jorcyk等[24]利用SV40攜帶前列腺蛋白prostatein的基因C3(1)的特異啟動子建立的轉(zhuǎn)基因小鼠可以完成演示前列腺上皮內(nèi)瘤變至侵襲性前列腺癌的整個病理變化過程，從而間接地證明了前列腺上皮內(nèi)瘤變與原發(fā)前列腺癌的關(guān)系。轉(zhuǎn)基因模型擴大了前列腺癌動物模型的選擇范圍，但由于專利原因，獲取前列腺癌轉(zhuǎn)基因模型費用高，且轉(zhuǎn)基因建模等待周期長，裸鼠難形成大體積瘤體，難以被常用的影像學檢測手段所捕捉到。

5 動物模型的影像學檢測評估手段

隨著熒光蛋白技術(shù)、光學成像技術(shù)、超聲探測技術(shù)、物理技術(shù)及數(shù)碼成像技術(shù)的迅猛發(fā)展，DR攝片、CT、ECT骨掃描、磁共振、三維超聲微成像及活體實時成像技術(shù)為我們提供活體觀測及檢查前列腺癌模型的瘤體創(chuàng)造了機會[25-27]。

熒光蛋白作為活體熒光探針，為我們研究活細胞提供了可視化的可能[28]。在活體熒光成像系統(tǒng)下直接觀察腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移的過程。Kolostova等[29]報道了通過外科手術(shù)原位種植熒光蛋白標記的前列腺腫瘤，并在活體成像系統(tǒng)觀測下進行腫瘤的耐藥性、轉(zhuǎn)移及血管形成研究的可行性。國內(nèi)后續(xù)由崔明星等[30]報道了通過GFP慢病毒感染的前列腺癌PC-3細胞系，細胞懸液腔靜脈注射1周后，即可通過動物活體成像系統(tǒng)直接觀測到裸鼠腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移情況。3個月后尸檢荷瘤鼠，發(fā)現(xiàn)裸鼠腰椎有腫瘤浸潤，與活體成像結(jié)果一致，腰椎轉(zhuǎn)移率為19%。與傳統(tǒng)的建立模型方法相比，GFP標記的前列腺癌動物模型具有便于觀測、敏感度高、動態(tài)連續(xù)性好及準確可信度高的特點。

裸鼠體積較小，前列腺原位模型體積更小，超聲在不損傷實質(zhì)臟器的前提下，可準確獲得深部瘤體體積。武國軍等[31]通過三維超聲微成像技術(shù)準確地獲取4～8月齡的PSP-TGAMP小鼠的前列腺成像，且成功發(fā)現(xiàn)了腹腔淋巴轉(zhuǎn)移圖像,對實驗中11只小鼠瘤體的三維超聲圖像獲得的最大直徑結(jié)果與大體腫瘤標本測量的數(shù)值進行了統(tǒng)計學分析，曲線符合線性回歸，皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.998。超聲在不損傷實質(zhì)臟器的前提下，可準確獲得深部瘤體體積。與傳統(tǒng)的二維超聲相比，三維超聲能夠顯著提高超聲微成像取得腫瘤體積的準確性和有效性。

目前，前列腺癌的動物模型的骨轉(zhuǎn)移表現(xiàn)主要為骨質(zhì)破壞與成骨改變。X線攝片發(fā)現(xiàn),骨質(zhì)破壞通常是發(fā)生在早期骨轉(zhuǎn)移2個月后，已滯后于癌灶的疾病進展。而在實驗中，我們采用X線攝片技術(shù)，可以直接簡明地觀察到前列腺動物模型的脛骨骨干的骨質(zhì)破壞情況[32]。

核素骨掃描檢查是臨床上普遍采用的可及早發(fā)現(xiàn)骨腫瘤的輔助檢查手段。Winkelmann等[33]利用PC-3細胞進行左心室注射，在接種后21 d微CT檢測出腰椎骨骨質(zhì)0.3 mm的骨破壞灶,并在29 d時采用微SPECT核素顯像儀檢測出骨轉(zhuǎn)移破壞呈現(xiàn)。核素骨掃描可因骨質(zhì)的炎癥與外傷等因素而易造成骨轉(zhuǎn)移的假陽性結(jié)果，要避免這些不利因素的影響才能準確地對動物荷瘤模型進行評價。

綜上所述，理想的前列腺癌模型是能夠模擬前列腺骨轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的病理過程，不僅要易于建立與重復，還要能接受精確的檢測評價方法?，F(xiàn)代前列腺癌動物模型，尤其是利用外科手段及基因手段建立的各種動物模型，是當下前列腺癌研究的重要平臺之一。隨著更加優(yōu)良的前列腺癌動物模型的建立，人們必將揭示前列腺癌的發(fā)病機制、疾病進展及癌腫侵襲轉(zhuǎn)移過程中的奧秘。

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