牛病毒性腹瀉病毒抗原抗體檢測(cè)方法研究進(jìn)展

趙 霞，岳海寧，馬占绔，李福虹

(1.青海省西寧市大通縣朔北獸醫(yī)站，青海西寧 810100;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅蘭州 730070)

牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea，BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的以牛發(fā)熱、粘膜糜爛潰瘍、腹瀉、咳嗽、母牛流產(chǎn)、繁殖障礙為主要特征的持續(xù)性感染病，是導(dǎo)致牛生產(chǎn)性能下降的主要疫病之一，呈世界性分布，給全球養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，我國(guó)養(yǎng)牛比較發(fā)達(dá)地區(qū)幾乎都存在該病的感染［1－4］。BVDV為黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的代表種，根據(jù)其5’端非翻譯區(qū)核酸序列分為基因I型和II型［5］。BVDV-I和BVDV-II所引起的臨床癥狀、發(fā)病特點(diǎn)及致病性明顯不同，BVDV-I常引起過(guò)性發(fā)熱、下痢和急慢性粘膜?。?］;BVDV-II在臨床上常表現(xiàn)為發(fā)燒、腹瀉、出血、呼吸失調(diào)、可引起懷孕母牛流產(chǎn)、死胎和新生小牛的先天畸形，對(duì)牛的致死率較高，危害性更為嚴(yán)重［7］。我國(guó)BVDV的主要流行毒株為BVDV-I型，但近年來(lái)分離與鑒定到BVDV-II型的報(bào)道逐漸增多［8－9］。只有研制快速、準(zhǔn)確、靈敏和特異的 BVDV檢測(cè)方法并將其推廣應(yīng)用，才能更好地診斷和控制該病。BVDV的常用診斷方法有病毒分離、電鏡檢查、中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和免疫熒光等，這些方法不僅操作繁瑣、復(fù)雜耗時(shí)、難以實(shí)現(xiàn)快速診斷，而且敏感性均較低，對(duì)處于免疫耐受和持續(xù)性感染牛容易出現(xiàn)漏檢。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)與免疫學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展與應(yīng)用，BVDV新型抗原抗體檢測(cè)方法不斷發(fā)展和完善。筆者就近年來(lái)針對(duì)BVDV的RT-PCR、熒光定量RT-PCR、RT-LAMP、ELISA和膠體金技術(shù)等抗原抗體新型檢測(cè)方法進(jìn)行了綜述，以期為不同實(shí)驗(yàn)室尋找適合的診斷方法以及發(fā)展新型診斷方法提供參考，為我國(guó)牛病毒性腹瀉病的綜合防控提供合理的科學(xué)依據(jù)。

1 牛病毒性腹瀉病毒的抗原檢測(cè)方法

1.1 RT-PCR

1.1.1 通用性RT-PCR及套式RT-PCR。王偉利等根據(jù)BVDV 5’端非編碼區(qū)(5’-UTR)設(shè)計(jì)合成l對(duì)特異性引物，建立檢測(cè)BVDV的RT-PCR方法，該方法對(duì)3株BVDV毒株的檢測(cè)均為陽(yáng)性，對(duì)牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、豬瘟病毒(CSFV)、牛輪狀病毒(BRV)、牛冠狀病毒(BCV)的檢測(cè)結(jié)果均呈陰性，與病毒分離試驗(yàn)的符合率達(dá)100%［10］。該方法特異性強(qiáng)，敏感性高，可以用于臨床BVDV的檢測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查。郭春娟等建立了檢測(cè)BVDV I型和Ⅱ型抗原的通用RT-PCR方法，該方法檢測(cè)BVDV I型和II型標(biāo)準(zhǔn)毒株均呈陽(yáng)性，檢測(cè) IBRV、CSFV、藍(lán)舌病病毒(BTV)、口蹄疫病毒(FMDV)、MDBK細(xì)胞均呈陰性，檢測(cè)的靈敏度為 10－1TCID50/ml，檢測(cè) 400 份臨床樣品，陽(yáng)性檢出率為 10.75%［11］，明顯高于ELISA檢測(cè)結(jié)果。該方法具有特異、靈敏、高效、快速、重復(fù)性好等特點(diǎn)，為BVDV的檢疫、診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供了一種有效的技術(shù)手段。Bachofen C等根據(jù)BVDV 5’-UTR設(shè)計(jì)引物，建立了從牛的血清中進(jìn)行BVDV檢測(cè)一步RT-PCR方法［12］，該方法放在1個(gè)96孔進(jìn)行PCR擴(kuò)增，提高了檢測(cè)速度，降低成本、操作時(shí)間和潛在的污染，具有高通量、低成本等優(yōu)點(diǎn)，值得推廣應(yīng)用。

祖立闖等根據(jù)BVDV 5＇非編碼區(qū)，設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，建立了檢測(cè)BVDV的套式RT-PCR方法，檢測(cè)CSFV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、MDBK細(xì)胞、IBRV、豬偽狂犬病毒(PRV)均呈陰性，第1輪RT-PCR檢測(cè)靈敏度為1 pg，而套式RT-PCR檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.1 pg。在臨床51份樣品的檢測(cè)中，第1輪RT-PCR檢測(cè)出陽(yáng)性樣品11份，而套式RT-PCR檢測(cè)出陽(yáng)性樣品22份［13］。套式RT-PCR極大地提高了常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法的特異性和敏感性，可以準(zhǔn)確快速檢測(cè)出極低含量的BVDV，為BVDV的早期感染和持續(xù)感染提供了簡(jiǎn)單、實(shí)用的有效診斷方法。

1.1.2 基因分型RT-PCR。熊浩等比較并分析了BVDV I型和II型5’-UTR，分別設(shè)計(jì)合成2對(duì)針對(duì)基因I型和II型的特異性檢測(cè)引物，通過(guò)對(duì)RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化建立了在同一反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)BVDV基因I型和Ⅱ型的雙重RTPCR方法，該方法對(duì)2個(gè)基因型的病毒檢測(cè)靈敏度均為2 TCID50，只比單重PCR的靈敏度降低了10倍，但具有較好的特異性和可重復(fù)性，對(duì)新疆5個(gè)不同牛場(chǎng)的175份流產(chǎn)牛全血和組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，共6份BVDV-I型陽(yáng)性，沒(méi)有檢測(cè)到BVDV-II型［14］。王克棟等根據(jù)BVDV I型和II型5’-UTR 分別設(shè)計(jì)合成2對(duì)引物，根據(jù)牛3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因設(shè)計(jì)合成1對(duì)引物，以牛GAPDH基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)建立了牛病毒性腹瀉病毒分型與內(nèi)標(biāo)三重RT-PCR檢測(cè)方法，該方法的靈敏度為100 TCID50，與不加內(nèi)標(biāo)檢測(cè)靈敏度相當(dāng)［15］，經(jīng)臨床樣品檢測(cè)驗(yàn)證具有較好的特異性和重復(fù)性，可用來(lái)對(duì)牛病毒性腹瀉病毒分型進(jìn)行快速準(zhǔn)確檢測(cè)。多重PCR方法可在同一個(gè)體系中同時(shí)對(duì)BVDV I型和II型基因進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對(duì)2個(gè)基因型的BVDV進(jìn)行同步分型檢測(cè)，大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)成本，為臨床中BVDV-I和BVDV-II的鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查等研究提供了有效技術(shù)支持。

1.2 熒光定量RT-PCR 任艷等以BVDV 5’-UTR為參考，設(shè)計(jì)并優(yōu)化1對(duì)特異的熒光定量PCR引物，建立一種快速、定量檢測(cè)BVDV的熒光定量RT-PCR方法，該方法的靈敏性比常規(guī)PCR高10倍，檢測(cè)變異系數(shù)低于1%，檢測(cè)25份不同地區(qū)采集的臨床癥狀疑似BVDV感染的牛糞樣品，陽(yáng)性檢出率為72%［16］。與病毒分離培養(yǎng)和電檢觀(guān)察相比，該方法具有快速、靈敏、特異、重復(fù)性好和能定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，為實(shí)驗(yàn)室快速、準(zhǔn)確檢測(cè)BVDV奠定了基礎(chǔ)。陳其兵等根據(jù)BVDV 5’UTR設(shè)計(jì)合成了1對(duì)特異性引物和1條TaqMan熒光探針，通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件和反應(yīng)體系的優(yōu)化建立了一種能快速定量檢測(cè)BVDV的熒光定量RT-PCR方法，該方法檢測(cè)CSFV、PRRSV、MDBK細(xì)胞均呈陰性，病毒含量的最低檢測(cè)限為103～104拷貝/ml，具有快速、特異、靈敏、重復(fù)性好等特點(diǎn)，可用于臨床及科研中對(duì)BVDV的快速定量檢測(cè)和肉類(lèi)食品進(jìn)出口檢疫［17］。熒光定量RT-PCR方法表現(xiàn)出更高的敏感性。熒光定量PCR檢測(cè)方法與RT-PCR檢測(cè)方法相比其敏感性與特異性更高，可以對(duì)BVDV進(jìn)行早期診斷，及時(shí)發(fā)現(xiàn)病源，且可以實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

1.3 RT-LAMP方法 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)檢測(cè)技術(shù)是在PCR方法上發(fā)展起來(lái)的新興核酸檢測(cè)技術(shù)，可在恒溫條件下方便、快速、靈敏、特異的檢測(cè)核酸，具有較高的臨床實(shí)用性。范晴等根據(jù)BVDV5’-UTR，在保守區(qū)的8個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)LAMP特異性引物，對(duì)反應(yīng)條件和試劑濃度進(jìn)行優(yōu)化，建立BVDV的RT-LAMP快速檢測(cè)方法，該方法在63.5℃的恒溫條件下65 min內(nèi)即可完成檢測(cè)，可通過(guò)觀(guān)察渾濁度或加入染料后直接判定擴(kuò)增結(jié)果。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)牛結(jié)核桿菌、BRV、CSFV、IBRV均為陰性，靈敏度可以達(dá)到 1 拷貝/μl，是常規(guī) RT-PCR 的 105倍［18］。Fan Q等建立了BVDV RT-LAMP快速檢測(cè)方法，該檢測(cè)與其他牛病毒沒(méi)有交叉反應(yīng)，與熒光定量RT-PCR方法同時(shí)檢測(cè)88份臨床樣品，RT-LAMP方法檢測(cè)出陽(yáng)性38份，熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)出陽(yáng)性39份，RT-LAMP方法的靈敏度與熒光定量RT-PCR方法相當(dāng)，可用于基層BVDV臨床病料的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和快速診斷［19］。RT-LAMP檢測(cè)方法快速、成本低、特異性好、靈敏度高、尤其適用于基層和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，為BVDV的檢測(cè)提供了新的技術(shù)方法，對(duì)BVDV的有效防制具有重要意義。

1.4 夾心ELISA方法 蔣穎等將BVDV 890株(BVDV-II型)病毒液濃縮并純化后免疫BALB/c小鼠制備的單克隆抗體3D8為捕獲抗體，單克隆抗體3F9經(jīng)生物素標(biāo)記后為檢測(cè)抗體，建立檢測(cè)BVDV的雙抗體夾心ELISA方法，該方法檢測(cè)BVDV 890株(BVDV-II)、NADL株(BVDV-I))、XJ-04株(BVDV-II)均呈陽(yáng)性，檢測(cè)CSFV、I型牛皰疹病毒(BHV-1)、BRV均呈陰性，對(duì)BVDV抗原的最低檢出量為84 ng/ml，檢測(cè)35份臨床病牛血清樣品，檢出陽(yáng)性血清13份，與RT-PCR的符合率達(dá)到94.29%［20］。該方法具有特異、靈敏、可靠、方便、快捷等特點(diǎn)，可廣泛推廣應(yīng)用，為我國(guó)BVDV的監(jiān)測(cè)提供了行之有效的技術(shù)手段。楊俊興用純化的BVDV作為抗原，經(jīng)動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、間接ELISA篩選和亞克隆，得到3株抗BVDV的單克隆抗體(2A6、2F4和5C9)，選用2A6和5C9作為包被抗體，用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的單克隆抗體2F4作為夾心抗體，建立了檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BVDV的雙單克隆抗體夾心ELISA方法，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BVDV(I型和II型)呈陽(yáng)性，檢測(cè)CSFV、赤羽病病毒(AKV)、BRV、FMDV均呈陰性，該方法與RT-PCR和商品化ELISA試劑盒的符合率分別為98.8%和99.0%［21］。該ELISA方法具有良好的特異性和敏感性，可以代替商品化ELISA試劑盒，可用于BVDV抗原快速檢測(cè)和對(duì)大量樣本的篩選。夾心ELISA檢測(cè)方法將單克隆抗體的特異性和酶標(biāo)記技術(shù)的敏感性有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，能夠在短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確、快速、直接檢測(cè)大批量樣品中的BVDV抗原，明顯優(yōu)于病毒分離和免疫熒光等方法，而且具有半自動(dòng)化的特點(diǎn)，更適合于各級(jí)獸醫(yī)研究機(jī)構(gòu)在大面積普查和流行病學(xué)調(diào)查中應(yīng)用。

2 牛病毒性腹瀉病毒的抗體檢測(cè)方法

2.1 間接ELISA方法 柴順秀等用BVDV重組E2蛋白作為包被抗原，HRP標(biāo)記葡萄球菌A蛋白(SPA)作為二抗，建立了檢測(cè)BVDV血清抗體的E2-PPA-ELISA方法，該方法檢測(cè)CSFV、BCV、BRV陽(yáng)性血清均呈陰性，靈敏度達(dá)1∶320，285份血清樣本的陽(yáng)性檢出率為33.4%，與IDEXX ELISA試劑盒的檢出率無(wú)明顯差異［22］。該方法具有良好的重復(fù)性、敏感性和特異性，為BVDV的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供一種快速、簡(jiǎn)便的血清學(xué)診斷方法，適合規(guī)?；B(yǎng)牛場(chǎng)BVDV的抗體監(jiān)測(cè)以及流行病學(xué)調(diào)查。Mayers J等建立了一種間接復(fù)合ELISA，可以同時(shí)檢測(cè)BVDV、BHV-1、牛副流感病毒3(BPV-3)和牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)抗體，減少了檢測(cè)試劑的成本，并簡(jiǎn)化了試驗(yàn)操作［23］。Lanyon S R等對(duì)BVDV特異性抗體ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行了臨床應(yīng)用和效果評(píng)價(jià)，采用ELISA和病毒中和試驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)125份牛血清樣品，采用ELISA和AGP同時(shí)檢測(cè)1 182份未免疫牛血清血清樣品，ELISA方法與病毒中和試驗(yàn)的敏感性和特異性分別為96.7% 和97.1%，ELISA方法與瓊擴(kuò)試驗(yàn)相比，敏感性更高［24］。Gonda M G等利用BVDV ELISA抗體檢測(cè)方法對(duì)BVDV疫苗免疫后的血清抗體效價(jià)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明ELISA方法可以用于BVDV-I型和II型中和抗體的效價(jià)檢測(cè)，評(píng)價(jià)疫苗免疫效果［25］。間接ELISA方法高通量、檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單，是目前常用的免疫學(xué)抗體診斷技術(shù)，可廣泛用于BVDV的抗體檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。

2.2 膠體金方法 張寧等利用BVDV標(biāo)準(zhǔn)毒株作為免疫原免疫健康家兔，制備抗BVDV高免血清，采用辛酸－硫酸胺法提純免疫球蛋白IgG，同時(shí)采用鞣酸－檸檬酸三鈉混合還原法制備5 nm膠體金顆粒。在電磁攪拌下，利用膠體金顆粒標(biāo)記兔抗BVDV IgG制備金標(biāo)抗體，采用雙抗體夾心法建立了檢測(cè)BVDV的斑點(diǎn)免疫金銀染色方法(Dot-ELISA)，該方法檢測(cè)CSFV、BRV、MDBK細(xì)胞、健康牛血樣均為陰性，抗原最低檢出量為0.335 μg/ml，該方法和AGP方法同時(shí)檢測(cè)78份河北省不同地區(qū)采集腹瀉奶牛血樣品，Dot-IGSS和AGP的陽(yáng)性檢出率分別為 58.97%和 34.62%［26］，Dot-IGSS 方法的陽(yáng)性檢出率明顯高于AGP方法。膠體金標(biāo)記技術(shù)具有快速、方便、簡(jiǎn)單、不需要昂貴儀器和專(zhuān)業(yè)人員、肉眼判讀、試驗(yàn)結(jié)果易保存等優(yōu)點(diǎn)，特別適合于基層獸醫(yī)部門(mén)和養(yǎng)殖場(chǎng)推廣應(yīng)用，具有廣闊的發(fā)展和推廣應(yīng)用前景，具有高度敏感性，非常適用于臨床診斷和檢疫。

3 小結(jié)

牛病毒性腹瀉是危害我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的主要疫病之一，加強(qiáng)其診斷技術(shù)研究與監(jiān)測(cè)工作對(duì)BVDV綜合防控措施的制定具有重要意義。對(duì)BVDV的檢測(cè)要力爭(zhēng)做到快速、敏感、準(zhǔn)確，這對(duì)于感染動(dòng)物的隔離與治療以及對(duì)未感染動(dòng)物快速采取預(yù)防措施都十分重要。目前，BVDV敏感、快速、特異的檢測(cè)技術(shù)主要有針對(duì)病毒DNA的抗原檢測(cè)技術(shù)和針對(duì)病毒產(chǎn)生抗體的抗體檢測(cè)技術(shù)，抗體檢測(cè)可以了解BVDV感染與發(fā)生進(jìn)程，但動(dòng)物在BVDV感染一定時(shí)間后才會(huì)產(chǎn)生抗體，因此抗體檢測(cè)存在一定的滯后性和局限性。分子生物學(xué)等抗原檢測(cè)方法可以敏感、特異地檢測(cè)出病毒核酸，其中熒光定量RT-PCR方法較RT-PCR方法更加敏感，但該方法對(duì)試驗(yàn)試劑與機(jī)器要求較高，難以在普通實(shí)驗(yàn)室普及應(yīng)用。RT-LAMP方法操作簡(jiǎn)單、不需要特殊儀器設(shè)備，肉眼判讀、特別適合于基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)快速、高通量，適合用于大批量樣品檢測(cè)和大面積流行病學(xué)調(diào)查。總而言之，BVDV的各種抗原抗體檢測(cè)方法均有優(yōu)缺點(diǎn)，可根據(jù)檢測(cè)實(shí)際選擇2種或2種以上方法進(jìn)行使用，相信隨著分子生物學(xué)與免疫學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展與應(yīng)用，牛病毒性腹瀉病毒新型抗原抗體檢測(cè)方法還會(huì)不斷完善，從而為我國(guó)牛病毒性腹瀉病的綜合防控提供更加合理依據(jù)。

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