光纖掃描式激光誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng)

楊曉博，閆衛(wèi)平，楊　飛，白海明

(1．許昌學(xué)院電氣信息工程學(xué)院，河南許昌　461000；2．大連理工大學(xué)電子科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連　116024)

0　引言

集成毛細(xì)管電泳(Integrated Capillary Electrophoresis，ICE)芯片[1-2]是微流控分析系統(tǒng)(Microfluidic Analysis System)的一個重要組成部分，被測樣品經(jīng)分離后的組分及含量要由檢測系統(tǒng)來測定[3]，因此，檢測系統(tǒng)的性能將決定整個微流控分析系統(tǒng)的精度、靈敏度、速度及適用范圍等。與傳統(tǒng)分析儀器相比，微流控分析系統(tǒng)要求檢測系統(tǒng)有更高的靈敏度、更快的響應(yīng)速度和更小的尺寸。

激光誘導(dǎo)熒光(Laser Induced Fluorescence，LIF)檢測是集成毛細(xì)管電泳芯片檢測方法中靈敏度和信噪比較高的一種[4]，但是傳統(tǒng)的共聚焦式LIF檢測系統(tǒng)體積龐大，不利于毛細(xì)管電泳檢測儀的進(jìn)一步微型化，因此，文中構(gòu)建出一種光纖掃描式毛細(xì)管電泳芯片LIF檢測系統(tǒng)，系統(tǒng)以光纖代替?zhèn)鹘y(tǒng)LIF系統(tǒng)中復(fù)雜龐大的共聚焦式檢測光路，采用雪崩二極管作為熒光檢測器件，從而構(gòu)建起結(jié)構(gòu)相對簡單、靈敏度高、功耗小的多通道毛細(xì)管電泳芯片檢測系統(tǒng)。

1　光纖掃描式激光誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

光纖掃描式四通道毛細(xì)管電泳芯片LIF檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1所示，它主要由機(jī)械掃描單元、熒光檢測光路、光電轉(zhuǎn)換單元和多通道識別單元四部分組成，各部分工作原理如下。

圖1　光纖掃描式毛細(xì)管電泳芯片激光誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖

1.1機(jī)械掃描單元

與齒輪、轉(zhuǎn)盤相連的電動機(jī)以一定的速率做勻速圓周運(yùn)動，從而使掃描軸在曲柄的帶動下在毛細(xì)管電泳芯片上方做一定角度的扇形掃描運(yùn)動，進(jìn)而固定在掃描軸上的激發(fā)光纖和接收光纖也隨之在芯片上方做往復(fù)的掃描，實(shí)現(xiàn)了多通道掃描功能。

1.2熒光信號檢測光路

激光器發(fā)出的綠色激光束經(jīng)激發(fā)光纖照射至多通道毛細(xì)管電泳芯片表面，當(dāng)光束照至電泳芯片上的微通道時，微通道中的熒光染料在激光的激發(fā)下產(chǎn)生熒光信號，該熒光信號通過接收光纖傳輸至光電轉(zhuǎn)換單元進(jìn)行處理。

1.3光電轉(zhuǎn)換單元

由于毛細(xì)管電泳芯片采用的是玻璃材料，不可避免的在其表面會產(chǎn)生光的反射和折射現(xiàn)象，因此，接收光纖中傳播的不僅僅有熒光染料受激發(fā)產(chǎn)生的熒光，同時芯片表面部分反射和散射的激發(fā)光也會通過接收光纖傳輸至信號處理單元。反射光及散射光是與被測熒光信號無關(guān)的干擾信號，需要在信號處理單元中將其濾除掉以提高系統(tǒng)的信噪比(Signal to Noise Ratio，SNR)。

1.4多通道識別單元

多通道識別單元由光調(diào)制板、發(fā)光二極管(Light Emitting Diode，LED)、光電接收器及信號處理電路組成。其中，光調(diào)制板上白色的透光區(qū)域和黑色的遮光區(qū)域相間排列，透光區(qū)域間的距離與多通道毛細(xì)管電泳芯片微分離通道之間的距離具有相同的對應(yīng)關(guān)系。

當(dāng)LED發(fā)出的光束照射至光調(diào)制板上的透光區(qū)域時，光電接收器檢測到光信號，輸出高電平；反之，當(dāng)光束照射至遮光區(qū)域時，光電接收器檢測不到光信號，輸出低電平。這樣，當(dāng)光調(diào)制板在掃描軸的帶動下在毛細(xì)管電泳芯片上方往返掃描時，光電接收器的輸出端就得到一個脈沖序列。通道識別脈沖如圖2所示，當(dāng)掃描軸從左向右掃描時，脈沖1和2之間對應(yīng)的是毛細(xì)管電泳芯片最左端的分離通道1，脈沖2和3之間對應(yīng)分離通道2，依此類推；反之，當(dāng)掃描軸從右向左掃描時，脈沖5和4之間對應(yīng)分離通道4，脈沖4和3之間對應(yīng)分離通道3，依此類推。當(dāng)掃描軸往復(fù)掃描時即實(shí)現(xiàn)了多通道識別功能。

圖2　毛細(xì)管電泳芯片通道識別脈沖序列圖

2　控制系統(tǒng)及硬件電路設(shè)計

控制系統(tǒng)采用STM32F103微處理器為核心芯片，利用其內(nèi)置的DMA、ADC、USB和UART控制器等實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的采集和上傳等功能。系統(tǒng)的總體結(jié)構(gòu)框圖如圖3所示，由STM32F103微處理器、光電轉(zhuǎn)換單元(包括光電傳感器、低噪聲放大器、低通濾波器)、電源及外圍電路、RS-232接口電路和USB接口電路等組成。

圖3　嵌入式控制系統(tǒng)整體結(jié)構(gòu)框圖

2．1雪崩二極管偏置電路

設(shè)計采用體積小、靈敏度較高的雪崩二極管作為光電轉(zhuǎn)換器件。雪崩二極管與光電倍增管相比具有偏置電壓低的優(yōu)點(diǎn)，與PIN光電二極管相比又具有較大的增益，非常適合微弱電泳熒光信號的測量。

電路采用C30902E型雪崩二極管。它的擊穿電壓較高，增益對外加偏壓變化敏感，因此需采用定制的專用高壓模塊作為偏置高壓源。雪崩二極管高壓偏置電路原理圖如圖4所示，其中Vref為高壓模塊控制信號輸入端，輸入電壓范圍為0 ～ 5 V，Vin為12 V電源輸入引腳，HV為高壓輸出引腳，輸出電壓范圍為0 ～ 400 V.此電路通過改變高精度電位器R1的阻值來調(diào)節(jié)輸出偏置電壓。圖中C1、C2為電源濾波電容，集成運(yùn)放LM358為電壓跟隨器，多圈高精度電位器R1的電壓信號通過電壓跟隨器送至高壓模塊的控制輸入端Vref．

圖4　雪崩二極管高壓偏置電路原理圖

2．2信號放大電路

針對雪崩二極管的特性，電路采用低噪聲、高輸入阻抗的OPA337放大器作為前置放大器，在A/D轉(zhuǎn)換前對前置放大器信號進(jìn)行二次放大和二階濾波。信號放大電路由兩級放大電路組成，電路原理圖如圖5所示。由于雪崩二極管輸出信號為電流信號，為實(shí)現(xiàn)低噪聲、高靈敏度放大，電路采用負(fù)反饋電流輸入前置放大器[5-6]。其中，電位器RV3、RV4用來調(diào)節(jié)運(yùn)算放大器的參考端電壓，用于對微弱被測信號進(jìn)行無失真放大；運(yùn)算放大器U7A和電阻R52構(gòu)成負(fù)反饋電流輸入放大器，用于對雪崩二極管輸出的微弱電流信號進(jìn)行放大；電容C67為相位補(bǔ)償電容；運(yùn)算放大器U8A和電阻R53、R55構(gòu)成反向比例放大電路，用于對第一級放大器的輸出信號進(jìn)行二次放大。

圖5　信號放大電路原理圖

2．3低通濾波電路

在掃描式毛細(xì)管電泳芯片LIF檢測系統(tǒng)中，熒光信號的檢測是通過對掃描得到的多通道脈沖信號采集來實(shí)現(xiàn)的。為了最大程度上抑制噪聲信號對數(shù)據(jù)采集的影響，需要對輸出脈沖的信號進(jìn)行濾波，因此，設(shè)計采用的濾波器為二階壓控電壓源(Voltage Controlled Voltage Source，VCVS)有源低通濾波器[7]。

由奈奎斯特采樣定理可知，在進(jìn)行模擬/數(shù)字信號的轉(zhuǎn)換過程中，當(dāng)采樣頻率fs大于信號中最高頻率fmax的2倍時，即fs≥2fmax，則采樣之后的數(shù)字信號便可完整保留原始信號中的信息。由于電路設(shè)計中的最低采樣頻率為7 kHz，因此截止頻率小于3．5 kHz的濾波器都可以滿足需要。二階VCVS有源低通濾波器電路原理圖如圖6所示，其截止頻率fc和增益K分別為：

圖6　二階VCVS有源低通濾波器電路原理圖

2．4通道識別電路

通道識別單元是掃描式LIF檢測系統(tǒng)的一個非常重要的組成部分，它主要由通道計數(shù)器復(fù)位電路和識別脈沖產(chǎn)生電路組成，其工作原理圖如圖7所示。圖中的運(yùn)算放大器LM358和電位器RV4構(gòu)成電壓比較器電路，用以對光電轉(zhuǎn)換單元輸出的信號進(jìn)行整形。在系統(tǒng)掃描檢測的過程中，當(dāng)光調(diào)制板的透光區(qū)與發(fā)光二極管、光敏三極管在垂直方向上重合時，二極管發(fā)出的光被光敏三極管接收，光電轉(zhuǎn)換后的脈沖信號作為主處理器的外部中斷信號，主處理器中的計數(shù)器對通道識別脈沖進(jìn)行計數(shù)，最后根據(jù)計數(shù)值并結(jié)合其他因素實(shí)現(xiàn)通道識別。

圖7　通道識別電路原理圖

3　系統(tǒng)軟件設(shè)計

在光纖掃描式毛細(xì)管電泳芯片LIF檢測系統(tǒng)的實(shí)現(xiàn)過程中，系統(tǒng)控制、數(shù)據(jù)的采集傳輸、波形繪制、檢測結(jié)果的顯示都是通過軟件實(shí)現(xiàn)的。由于實(shí)時操作系統(tǒng)不僅能提供靈活的編程接口和豐富的任務(wù)管理及任務(wù)間通信機(jī)制，同時又能簡化嵌入式軟件的開發(fā)過程、縮短調(diào)試周期，此外，實(shí)時操作系統(tǒng)本身所占內(nèi)存資源較少、CPU占用率低、便于以后對功能進(jìn)行擴(kuò)展，因此設(shè)計采用嵌入式操作系統(tǒng)μ COS-II作為軟件開發(fā)的支持平臺，結(jié)合STM32 Firmware函數(shù)庫及μCOS內(nèi)核實(shí)現(xiàn)設(shè)備控制及數(shù)據(jù)采集功能。在PC端采用Visual C++為開發(fā)環(huán)境，使用Win32 API操縱PC機(jī)的串口實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的采集，借助于Microsoft Foundation Class的強(qiáng)大圖形繪制及顯示功能實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)波形的繪制及檢測結(jié)果的顯示。

4　測試結(jié)果及分析

4．1毛細(xì)管電泳芯片結(jié)構(gòu)

光纖掃描式LIF系統(tǒng)中使用的四通道毛細(xì)管電泳芯片結(jié)構(gòu)如圖8所示。其中1、2、3、4分別為樣品池、樣品廢液池、緩沖液池、緩沖廢液池；進(jìn)樣通道長10 mm，分離通道長40 mm，檢測點(diǎn)與十字交叉點(diǎn)處的距離為30 mm；通道深60 μm，寬100 μm，儲液池直徑為2 mm，容積約為5 μL；整個芯片尺寸為60 mm × 50 mm．

圖8　四通道毛細(xì)管電泳芯片結(jié)構(gòu)示意圖

4．2電泳分離實(shí)驗(yàn)操作

毛細(xì)管電泳分離實(shí)驗(yàn)的步驟為：配置緩沖液和羅丹明B樣品溶液；清洗芯片通道，然后置于恒溫箱中烘干；將緩沖液注入電泳通道，用光學(xué)顯微鏡觀察通道中有無氣泡和微小顆粒，確定沒有后準(zhǔn)備進(jìn)入下一階段；設(shè)置進(jìn)樣電壓和分離電壓(進(jìn)樣電壓：樣品池600 V，樣品廢液池0 V，緩沖液池400 V，緩沖廢液池600 V；分離電壓：緩沖液池800 V，樣品池、樣品廢液池均為600 V，緩沖廢液池0 V)；芯片置于檢測平臺之上，調(diào)整掃描探頭與芯片間的垂直和水平方向上的距離，以達(dá)到最佳檢測位置；將樣品溶液注入樣品池，插入電極；起動高壓電源和檢測系統(tǒng)的掃描檢測，繪制檢測結(jié)果；待檢測曲線繪制完畢后，如果二次進(jìn)樣則重復(fù)上述過程，否則關(guān)閉系統(tǒng)；取出芯片后用無水乙醇進(jìn)行清洗；待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢查系統(tǒng)。

4．3樣品的進(jìn)樣和分離

此時，四通道毛細(xì)管電泳芯片的第1、2通道注入純凈水，第3、4通道分別注入1．0 × 10-5M、1．0 × 10-4M

的羅丹明B樣品溶液并施加分離電壓。檢測系統(tǒng)對四通道掃描得到的電泳譜圖如圖9所示。由于第1、2通道中注入的為純凈水，它們的檢測信號幅值為零，其檢測曲線相互交疊，并與橫軸相重疊。另外的兩條曲線則反映了毛細(xì)管電泳分離的過程：開始進(jìn)樣時，樣品還沒有進(jìn)入分離通道，放置在檢測部位的光電探測器沒有檢測到激光激發(fā)出的熒光信號，故曲線前一部分值為零；當(dāng)樣品被切換到分離通道，并在分離電壓的作用下移動到光電探測器檢測部位時，激光激發(fā)出的熒光信號立即被光電探測器接收，對應(yīng)的檢測曲線出現(xiàn)峰值；當(dāng)樣品全部通過檢測點(diǎn)后，沒有熒光信號，檢測曲線值重新降為零。此外，由于通道4中樣品的濃度較大，因此，其對應(yīng)的電泳譜圖峰值也較大。

圖9　四通道毛細(xì)管電泳芯片不同濃度樣品時的電泳分離譜圖

5　結(jié)束語

文中主要圍繞LIF檢測原理，利用光纖搭建激發(fā)及檢測光路，設(shè)計出掃描式多通道毛細(xì)管電泳芯片檢測系統(tǒng)。系統(tǒng)采用曲軸完成了電機(jī)的勻速旋轉(zhuǎn)到掃描軸的掃描這一轉(zhuǎn)變，實(shí)現(xiàn)了對多通道毛細(xì)管電泳芯片的掃描式檢測。系統(tǒng)對不同濃度的羅丹明B樣品溶液進(jìn)行了電泳分離實(shí)驗(yàn)，檢測結(jié)果表明搭建的光纖掃描式LIF檢測系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對多通道毛細(xì)管電泳芯片的實(shí)時并行檢測。

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