新疆民族特色酸奶及酸奶疙瘩中乳酸菌的分離鑒定及其生物膜形成能力檢測

(1新疆南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 阿拉爾 843300)(2新疆塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 新疆 阿拉爾 843300)(3 遼寧大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 遼寧 大連 116000)

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一類能夠發(fā)酵碳水化合物主要產(chǎn)物為乳酸的無芽孢、革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱。它在自然界中廣泛存在，它不僅可以提高食品附加值和保藏性，還能幫助調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，具有促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)有效吸收的保健功能[1]。近年來，乳酸菌已經(jīng)作為益生菌廣泛應(yīng)用于食品及藥品領(lǐng)域中，含有大量乳酸菌的乳制品是營養(yǎng)與保健功能兼?zhèn)涞默F(xiàn)代人的理想食品之一。新疆民族特色酸奶及酸奶疙瘩因其獨(dú)特的風(fēng)味及豐富的營養(yǎng)逐漸成為一種流行的優(yōu)質(zhì)食品。酸奶疙瘩是酸奶子的結(jié)晶體，是哈薩克族、柯爾克孜族及蒙古族等少數(shù)民族牧民家制的自然發(fā)酵奶制品之一，它是采用牛(羊)奶自然發(fā)酵后去水自然干燥成的固體或半固體食品[2]。千百年來新疆牧民沿襲古老而傳統(tǒng)的方法制作的酸奶疙瘩具有風(fēng)味獨(dú)特的特點(diǎn)，這表明酸奶疙瘩中蘊(yùn)含有傳代性好、抗逆性強(qiáng)、風(fēng)味獨(dú)特的乳酸菌菌群，進(jìn)而可以分離篩選出發(fā)酵性能良好的乳酸菌，應(yīng)用于發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)中。國內(nèi)學(xué)者對(duì)新疆酸奶及酸奶疙瘩中乳酸菌也有報(bào)道，趙蕊[3]等對(duì)15份采自新疆伊犁牧民家庭傳統(tǒng)方法制作的酸奶子中分離出71株乳酸菌，并發(fā)現(xiàn)乳桿菌為優(yōu)勢菌，其中瑞士乳桿菌(L.helveticu)為最優(yōu)勢種；彭斌[2]等對(duì)對(duì)采自新疆伊犁、塔城、烏魯木齊白楊溝的傳統(tǒng)奶疙瘩中的乳酸菌進(jìn)行了分離，經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化試驗(yàn)，得到初步定為乳酸菌的菌株18株；而對(duì)于新疆其他地區(qū)牧民家庭自制的酸奶及酸奶疙瘩的研究并未見報(bào)道。乳酸菌能夠產(chǎn)生多種有益的代謝產(chǎn)物，例如乳酸、細(xì)菌素、胞外多糖等。胞外多糖是由發(fā)酵產(chǎn)生的、分泌于細(xì)胞外的一種糖類化合物，它對(duì)改善發(fā)酵乳制品的組織狀態(tài)起著重要作用。同時(shí)，它也是細(xì)菌形成生物膜結(jié)構(gòu)的必需物質(zhì)。生物膜是一種黏附于生物或者非生物材料表面由細(xì)菌群體和包裹群體的基質(zhì)組成的聚合體[3]。這種包裹菌體的基質(zhì)是生物膜形成的必要條件，其主要成分即為胞外多糖，占總量的50%～90%[4]。目前有關(guān)將微生物生物膜的特性應(yīng)用于生防試劑、生物反應(yīng)器及生物修復(fù)等方面已有較多報(bào)道，乳酸菌是一類公認(rèn)安全的益生菌，其生物膜的應(yīng)用前景更為廣闊。

本研究以新疆民族特色乳制品為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行乳酸菌的分離，然后采用生理生化檢測與分子生物學(xué)手段相結(jié)合的方法對(duì)乳酸菌進(jìn)行鑒定，然后探索其生物膜的形成情況，為更進(jìn)一步開發(fā)利用乳酸菌資源及乳酸菌生物膜奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

PCR儀(Bio-Rad)，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Labphil)，恒溫培養(yǎng)箱(上海)，移液器( Eppendorf)，吸收光酶標(biāo)儀(Biolog ELx808TM)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

MRS肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)，PCR相關(guān)試劑均購自Takara公司，碳源利用試驗(yàn)中的各種糖醇類試劑均為進(jìn)口分裝，其他實(shí)驗(yàn)相關(guān)藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.3 樣品采集

樣品為分別采自從新疆克孜勒蘇柯爾克孜自治州阿合奇縣、伊犁哈薩克自治州那拉提草原及新源縣城、哈密地區(qū)巴里坤草原等地區(qū)的酸奶及奶疙瘩等民族特色乳制品。

1.4 乳酸菌的分離純化及鑒定

1.4.1 乳酸菌的分離及純化

液體樣品直接劃線接種于固體MRS平板；固體樣品表面用無菌生理鹽水清洗，研碎后以1:9的比例置于MRS液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)[1]，37 ℃靜置培養(yǎng)24～48 h，梯度稀釋后劃線接種于固體MRS平板；MRS瓊脂培養(yǎng)基均添加有1/10 000濃度放線菌酮，接種后置于37 ℃條件下培養(yǎng)24～72 h。將分離純化后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色及過氧化氫酶測定，將革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的菌株暫定為乳酸菌[5]。將其用甘油管保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.4.2 乳酸菌的理化鑒定

參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]，對(duì)分離純化的乳酸菌進(jìn)行生理生化鑒定，包括葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)、耐鹽性試驗(yàn)、溫度生長試驗(yàn)、pH耐受試驗(yàn)、碳源利用試驗(yàn)(包括阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、鼠李糖、核糖、山梨醇、蔗糖、木糖、棉籽糖)、明膠液化試驗(yàn)、石蕊牛奶試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)等。

1.4.3 乳酸菌16S rDNA測序分析[9]

采用SDS法提取細(xì)菌基因組DNA，對(duì)其進(jìn)行16S rDNA測序分析。革蘭氏陽性細(xì)菌的通用引物作為擴(kuò)增引物，上游引物(27F)：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’；下游引物(1492R)：5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’；擴(kuò)增條件為：94 ℃，5 min；(94 ℃，30 s；55 ℃，1 min；72 ℃，1. 5 min；30個(gè)循環(huán))；72 ℃，10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，120 V電泳30 min，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)成像，將PCR產(chǎn)物送至上海生工測序。測序結(jié)果與Genbank中的序列進(jìn)行同源性比對(duì)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，將比對(duì)結(jié)果作為菌株最終的鑒定結(jié)果。

1.5 乳酸菌生物膜形成情況檢測

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[9-10]并略作改動(dòng)，采用微量板半定量法對(duì)所分離得到的乳酸菌進(jìn)行生物膜形成能力檢測。按1:200的比例接種過夜培養(yǎng)的菌液至MRS液體培養(yǎng)基中，吸取200 μL上樣至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h，拍出培養(yǎng)液，無菌水洗板4次，56 ℃烘干固定1 h，50 μL 0. 5%結(jié)晶紫染色5 min，自來水沖洗除去多余染液，37 ℃晾干，用酶標(biāo)儀測定波長490 nm處的OD值。每一培養(yǎng)板中同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照(ATCC 35984)、陰性對(duì)照(ATCC 12228)與空白對(duì)照(等體積的空白MRS培養(yǎng)基)，所有生物膜形成檢測試驗(yàn)均在不同時(shí)間重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆民族特色酸奶及酸奶疙瘩中乳酸菌多樣性分析

經(jīng)分離純化后共獲得110株乳酸菌，分別通過生理生化及分子生物學(xué)鑒定后，乳酸菌分布情況見表1。從表中可以看出，在本研究中，新疆民族特色酸奶及酸奶疙瘩中所分離得到的戊糖乳桿菌(L.pentosus)，占菌株總數(shù)的48. 18%，在本研究結(jié)果中為優(yōu)勢種；其次為副干酪乳桿菌(L.paracasei)，占菌株總數(shù)的25. 45%；同時(shí)發(fā)現(xiàn)乳桿菌占所分離菌株總數(shù)的92. 72%，在所采集的樣本中為絕對(duì)優(yōu)勢菌屬，主要可能有兩個(gè)方面的原因，一是與所采集的酸奶及酸奶疙瘩樣品酸度較高有關(guān)系，一般來說，酸度高有利于乳酸桿菌的生長，而會(huì)抑制乳酸球菌的生長。據(jù)報(bào)道，新疆塔城地區(qū)酸奶疙瘩的酸度平均為2. 8(酸度以乳酸計(jì))[2]。酸度高也有利于抑制霉菌的生長；二是可能與所采用的分離培養(yǎng)基有關(guān)，MRS培養(yǎng)基所含有的營養(yǎng)物質(zhì)更適合于乳酸桿菌的生長繁殖[12]，導(dǎo)致在所分離的菌株中乳桿菌為絕對(duì)優(yōu)勢菌屬。另外，還發(fā)現(xiàn)了一株潛在新種，編號(hào)為48，屬于腸球菌屬，其最相近種為屎腸球菌(EnterococcusfaeciumATCC 19434)，經(jīng)測序比對(duì)之后其16S rRNA相似度為93. 9%，該菌株的進(jìn)一步鑒定工作正在進(jìn)行中。所分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析見圖1。從圖1中可以看出，所分離得到的乳酸菌分布在2個(gè)屬，共10個(gè)種，其中潛在新種屬于腸球菌屬，命名為Enterococcusxinjiangensis-48。

表1 所分離乳酸菌分布情況

續(xù)表1 所分離乳酸菌分布情況

圖1 所分離乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2 乳酸菌生物膜形成能力檢測

對(duì)所分離得到的110株乳酸菌進(jìn)行生物膜形成能力檢測，結(jié)果如圖2所示。在檢測的乳酸菌中，生物膜為陽性的共70株，占菌株總數(shù)的63. 64%。在本研究中檢測的生物膜陽性乳酸菌全為乳酸桿菌，并且生物膜陽性乳桿菌的比例占總數(shù)的68. 32%，從中可以看出乳桿菌生物膜形成能力較強(qiáng)，這可能與大多數(shù)乳桿菌都能夠分泌合成大量胞外多糖所致。在生物膜陽性的乳桿菌中，戊糖乳桿菌(L.pentosus)共43株，占生物膜陽性菌株總數(shù)的62. 32%，同時(shí)占戊糖乳桿菌總分離菌株數(shù)的81. 13%；副干酪乳桿菌(L.paracasei)，占生物膜陽性菌株數(shù)的26. 09%，占總分離菌株數(shù)的64. 29%。另外值得指出的是，所分離的9株腸球菌屬的乳酸菌，其生物膜表型檢測均為陰性，這可能是因?yàn)楸狙芯恐兴蛛x得到的均為屎腸球菌(E.faecium)，而國內(nèi)外所報(bào)道的能夠形成生物膜的腸球菌多為糞腸球菌(E.faecalis)，而無屎腸球菌，可能是因?yàn)樵摲N腸球菌形成胞外多糖的能力有限所致。

圖2 所分離乳酸菌部分菌株生物膜形成情況

有文獻(xiàn)[13]指出，生物膜的光密度值(即OD值)能夠反映生物膜與接觸表面黏附的牢固程度，依據(jù)臨界OD490值(指空白孔的平均OD490值加上其3倍標(biāo)準(zhǔn)差而得到)可將生物膜進(jìn)行分類，分別分為陰性(-)、弱陽性(+)、中等陽性(++)及強(qiáng)陽性(+++)，在本研究中經(jīng)試驗(yàn)得出臨界OD490值為0. 14，所分離乳酸菌中生物膜形成情況見表2。從表2中可以看出，乳桿菌所形成的生物膜將近一半均為強(qiáng)陽性生物膜(OD490>0. 56)，該結(jié)果也更進(jìn)一步說明乳酸菌，尤其是乳桿菌具有較強(qiáng)的生物膜形成能力，這為更進(jìn)一步開發(fā)利用乳酸菌生物膜的特性奠定基礎(chǔ)。

表2 不同乳酸菌生物膜形成情況及其分布

3 討論

新疆是一個(gè)多民族聚居的地區(qū)，在這里少數(shù)民族一直都有食用自制發(fā)酵乳制品的習(xí)慣。這些民族特色發(fā)酵乳制品風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)價(jià)值極高，同時(shí)富含本地區(qū)自然環(huán)境中豐富的微生物資源，乳酸菌即是其重要的組成部分。乳酸菌具有維持腸道菌群微生態(tài)平衡，降低血清膽固醇、抗氧化、防癌抗癌等功效[14]。在本研究中，所得到的乳桿菌占分離乳酸菌總數(shù)的92. 72%，為絕對(duì)優(yōu)勢種群，分析其原因可能是與采集樣品酸度高及分離培養(yǎng)基有關(guān)。由于酸度高，因此耐酸性差的乳球菌到發(fā)酵后期難以存活，所以很難從中分離出乳球菌。該結(jié)果也與孫天松[6]等得到的結(jié)果相一致。有學(xué)者[15][16]對(duì)內(nèi)蒙古及青海等地區(qū)傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌進(jìn)行分離得出，乳桿菌也均為其優(yōu)勢種群。這體現(xiàn)了乳桿菌作為發(fā)酵乳制品的優(yōu)勢菌種的重要地位。從表2中可以看出，不同乳桿菌生物膜的形成能力存在很大差異，同一種的乳酸菌其生物膜形成能力也極為不同。例如所分離得到的53株戊糖乳桿菌(L.pentosus)，在四種類型的生物膜形成能力中均有分布，并且比例大致為1:1:1:2，分布較為平均。這可能是由于在同一種乳酸菌中還存在眾多亞種，各個(gè)亞種之間存在差異，編碼各自生物膜形成的基因不同，導(dǎo)致生物膜表型不一致。對(duì)于同一種內(nèi)的亞種，還有待采用進(jìn)一步的分析檢測手段進(jìn)行區(qū)分。

乳酸菌代謝產(chǎn)物如乳酸、細(xì)菌素及胞外多糖等廣泛應(yīng)用于食品藥品領(lǐng)域。胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)是由乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的、分泌于細(xì)胞外的、常滲入培養(yǎng)基中的一種糖類化合物[17]，它是近十年來乳品科學(xué)的研究熱點(diǎn)。在乳酸菌中，有關(guān)乳桿菌胞外多糖的研究報(bào)道越來越多。大多數(shù)產(chǎn)EPS 乳桿菌菌株是從發(fā)酵乳及乳制品、發(fā)酵肉制品以及發(fā)酵蔬菜中分離獲得的。胞外多糖的重要作用之一在于它是一種天然的增稠劑，可以改善發(fā)酵乳制品的流變學(xué)特性。同時(shí)EPS也是一種物理穩(wěn)定劑，能夠結(jié)合水并限制物料脫水收縮，賦予產(chǎn)品吸引人的外觀和令人滿意的口感[18]。另外，EPS還與乳酸菌生物膜的形成有直接關(guān)系，是生物膜形成的必需條件，從本研究中這一點(diǎn)也得到了證實(shí)。所分離菌株的生物膜陽性率高達(dá)63. 63%，并且全部為乳桿菌，這與乳桿菌具有較強(qiáng)的發(fā)酵產(chǎn)生EPS的能力密切相關(guān)。乳酸菌生物膜的形成可能也與奶源關(guān)系密切，少數(shù)民族牧民制作乳制品通常采用馬奶、羊奶等作為原料，這些奶源中乳糖含量豐富，因此為乳酸菌發(fā)酵提供了充足的碳源，產(chǎn)生了大量的胞外多糖，進(jìn)而能夠形成生物膜結(jié)構(gòu)。

4 結(jié)論

4.1 本研究從采集自新疆四個(gè)地區(qū)的傳統(tǒng)民族乳制品酸奶子及酸奶疙瘩中分離獲得乳酸菌共110株，經(jīng)生理生化檢測及分子生物學(xué)鑒定得出，L.pentosus53株，L.kefir10株，L.paracasei28株，L.plantarum4株，L.diolivorans3株，E.faecium8株，L.paraplantarum、L.gallinarum、L.sunkii各1株；還有1株經(jīng)16S測序比對(duì)后與已知菌株基因序列相似性低于97%(93. 9%)，為疑似新種，尚在進(jìn)一步研究中；乳桿菌為本研究所分離菌株的絕對(duì)優(yōu)勢菌屬，可能與所采集樣品酸度較高及所使用的分離培養(yǎng)基有關(guān)；

4.2 對(duì)所分離獲得的110株乳酸菌進(jìn)行生物膜形成能力檢測，結(jié)果顯示生物膜陽性率高達(dá)63. 64%，這其中強(qiáng)陽性菌株(OD490>0. 56)32株，中等陽性菌株(0. 28

4.3 本研究中生物膜陽性菌株均為乳桿菌，腸球菌生物膜表型均為陰性，其中80%以上的L.pentosus生物膜表型為陽性。乳桿菌胞外多糖不僅在發(fā)酵乳的流變學(xué)特性、產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)和質(zhì)地以及口感等方面起到重要作用，還具有抗癌、抗?jié)?、免疫調(diào)節(jié)或降膽固醇等活性，逐漸成為近年來研究熱點(diǎn)，而對(duì)乳桿菌生物膜特性的應(yīng)用及研究尚處于初級(jí)階段，亟待進(jìn)一步的開發(fā)利用。

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