扁桃莖尖包埋玻璃化超低溫保存條件研究

陳加利 姜 喜 肖 巍 劉建亮 王 琳 李志軍

(1塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300)(2新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木盆地生物資源保護與利用重點實驗室 新疆 阿拉爾843300)

扁桃(Amygdalus communi L.)又名巴旦杏，為落葉喬木，其果仁營養(yǎng)價值很高并具有一定食療功效和經(jīng)濟價值[1]。在我國扁桃栽培已有 1 300余年的歷史，扁桃資源豐富，在我國自行培育和引進的品種有200多個，其中新疆約有90多個[2]。扁桃種子繁殖后代性狀易發(fā)生分離，不宜作為扁桃種質(zhì)資源保存的有效方式；田間種植保存占地面積大，耗費人力和物力，易受環(huán)境的影響；目前多數(shù)采用扁桃接穗來進行繁殖和保存，但其種質(zhì)資源并沒有系統(tǒng)地被保存，致使一些扁桃資源面臨喪失的危險。李康[3]、姜俊卿[4]、高疆生[5]等對新疆扁桃在組織培養(yǎng)方面已有一些報道，但用常規(guī)的離體保存方法需經(jīng)常繼代，容易污染和發(fā)生體細(xì)胞變異。越來越多的研究結(jié)果表明，包埋玻璃化超低溫保存法是一種操作簡單、能同時處理大量材料，對材料毒害作用小、可長期穩(wěn)定保存種質(zhì)資源的一種有效途徑，該方法已成功應(yīng)用在桃[6]、李[7、8]、蘋果[9]、青島百合[10]、山藥[11]、葡萄[12]和懷地黃[13]等多種植物的莖尖保存上。為此，本實驗以莎車18號扁桃莖尖為試材，研究影響其莖尖包埋玻璃化法超低溫保存的一些因素, 為扁桃種質(zhì)資源的長期保存提供一條有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

2013年3月中旬采自塔里木大學(xué)園藝試驗站的莎車18號扁桃。

1.2 方法

本試驗主要從低溫鍛煉時間、預(yù)處理時間和預(yù)處理濃度、裝載液處理時間、玻璃化( PVS2) 液處理時間5個方面進行研究。

1.2.1 再生無菌苗的獲得 選取一年生枝條剪去葉片，用自來水沖洗干凈，取帶腋芽的莖段2～3 cm及頂芽，倒入吐溫用流水沖洗30 min左右，然后置于超凈工作臺下，用70%酒精滅菌8 s，再用2%濃度的次氯酸鈉消毒處理10 min，無菌水沖洗3遍后，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，即MS+6-BA0. 3 mg/L+IAA0. 3 mg/L。30d后將萌芽切下轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基MS+6-BA1. 0 mg/L+IAA0. 1 mg/L，培養(yǎng)室內(nèi)溫度為(25±2) ℃，光照強度為1 200～2 000 lx，每日光照為16 h，8 h黑暗。

1.2.2 低溫鍛煉 將繼代培養(yǎng)1個月的試管苗置于4 ℃恒溫恒濕箱中進行低溫鍛煉，并設(shè)置時間梯度，分別為0、1、2、3、4、5和6周。

1.2.3 包埋 在超凈工作臺上取低溫鍛煉后的莎車18號扁桃試管苗，在培養(yǎng)皿上切取長約2 mm的莖尖，用鑷子將切好的莖尖放入已配好并高溫滅菌過的3%(w/v)海藻酸鈉(包含0. 4 mol/L蔗糖和無鈣離子MS)中。用無菌的膠頭滴管吸取莎車18號扁桃莖尖，滴到0. 4 mol/L蔗糖的0. 1 mol/LCaCl2溶液中，每一滴含有一個莖尖并在常溫下固定30 min后形成直徑約4 mm的包埋丸，將其取出待用。

1.2.4 預(yù)培養(yǎng) 將莎車18號扁桃莖尖包埋丸放入含有0、0. 1、0. 3、0. 5和0. 7 mol/L蔗糖+5%二甲基亞砜(DMSO)的MS培養(yǎng)基上，分別預(yù)培養(yǎng)1 d、2 d和3 d。

1.2.5 裝載液處理 預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后將莎車18號扁桃莖尖包埋丸放入1. 8 mL的冷凍管中(10個/管)，重復(fù)3次，用裝載液(MS+2 mol/L甘油+0. 4 mol/L蔗糖)于25 ℃±2 ℃處理0、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min。

1.2.6 玻璃化液處理 用無菌膠頭滴管吸出裝載處理液，加入玻璃化溶液PVS2并在0 ℃冰水混合物條件下處理0 min、10 min、30 min、50 min、70 min和90 min，處理后換上新鮮的PVS2，將冷凍管放入紗布袋中，迅速將冷凍管浸入液氮中。其中玻璃化液PVS2是由30%甘油、15%二甲基亞砜、15%乙二醇和0. 4 mol/L蔗糖組成。

1.2.7 化凍、洗滌、活性檢測和恢復(fù)培養(yǎng) 莎車18號扁桃莖尖包埋丸超低溫保存24 h后取出，放入40 ℃水浴鍋中化凍1～2 min，用1. 2 mol/L蔗糖的MS洗滌液清洗2次，每次10 min，用無菌濾紙吸去殘留在莎車18號扁桃莖尖包埋丸表面的洗滌液，用TTC法[14]檢測莎車18號扁桃莖尖成活率，或接種到MS+6-BA0. 3 mg/L+IAA 0. 3 mg/L培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)15d后，轉(zhuǎn)移到正常條件下(25 ℃，1 500 lx)，觀察其再生情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫鍛煉對扁桃莖尖包埋玻璃化超低溫保存后存活率的影響

對扁桃莖尖進行不同時間低溫鍛煉處理，經(jīng)過超低溫保存后發(fā)現(xiàn)，低溫鍛煉影響保存后莖尖存活率。由圖1可知，在4 ℃條件下扁桃莖尖隨著低溫鍛煉時間的延長，其存活率不斷增加，但4周后存活率不斷降低。低溫鍛煉4周時，扁桃莖尖存活率達最高，為62. 1%；而不經(jīng)低溫鍛煉處理的扁桃莖尖存活率為0，經(jīng)過1周低溫鍛煉的扁桃莖尖存活率較低，達2.3%。

圖1 低溫鍛煉對存活率的影響

圖2 預(yù)處理對存活率的影響

2.2 預(yù)培養(yǎng)對莎車18號扁桃莖尖包埋玻璃化超低溫保存后存活率的影響

預(yù)處理液濃度和預(yù)培養(yǎng)時間對莎車18號扁桃莖尖超低溫保存后的存活率有較大的影響。經(jīng)5%DMSO和不同濃度蔗糖預(yù)培養(yǎng)的扁桃莖尖超低溫保存后的存活率高于不進行5%DMSO和蔗糖濃度預(yù)培養(yǎng)的莖尖。由圖2表明，預(yù)處理時間不同，扁桃莖尖存活率變化趨勢不同。常溫條件下預(yù)培養(yǎng)1 d時，扁桃莖尖存活率隨5%DMSO和蔗糖濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；預(yù)培養(yǎng)2 d時，扁桃莖尖存活率隨蔗糖濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢；而預(yù)培養(yǎng)3 d時，扁桃莖尖存活率隨蔗糖濃度的增加逐漸升高，但扁桃莖尖的存活率沒有預(yù)培養(yǎng)1 d的高。綜合考慮，扁桃莖尖包埋丸用0.3 mol/l蔗糖和5%DMSO處理液處理1天效果最好，扁桃莖尖存活率高，達43%。

2.3 裝載時間對莎車18號扁桃莖尖包埋玻璃化超低溫保存后存活率的影響

裝載液處理是莎車18號扁桃莖尖包埋玻璃化法超低溫保存必不可少的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，扁桃莖尖包埋丸用0. 3 mol/l蔗糖處理液處理1天后用裝載液進行裝載0～60 min。由圖3可以看出，莎車18號扁桃莖尖包埋丸進行裝載后，隨裝載時間的增加，超低溫保存后的存活率呈先增加后降低的趨勢，用裝載液處理20 min、40 min扁桃莖尖存活率較高，均達90%。

圖3 裝載時間對存活率的影響

圖4 PVS2處理對存活率的影響

2.4 PVS2處理時間對莎車18號扁桃莖尖包埋玻璃化超低溫保存后存活率的影響

用玻璃化保護液PVS2處理莎車18號扁桃莖尖包埋丸可脫去莖尖中過多的水分，使扁桃莖尖完全玻璃化，并使冷凍保護液滲入細(xì)胞而減輕在超低溫保存過程中細(xì)胞所受的傷害[15]。由圖4可以看出，玻璃化保護液PVS2處理50 min時，扁桃莖尖存活率最高，達52%。未經(jīng)PVS2處理的莎車18號扁桃莖尖超低溫保存后存活率為0；玻璃化保護液PVS2處理50 min、70 min和90 min 的莖尖凍后存活率高于10 min和30 min的處理。

3 結(jié)果與討論

在植物超低溫保存過程中，許多植物需要適當(dāng)?shù)牡蜏劐憻拋硖岣咂涑蜏乇４婧蟮某苫盥剩驗榈蜏劐憻捒梢蕴岣咧参矬w內(nèi)脯氨酸和多胺的含量以及細(xì)胞液的滲透勢，從而增加植物的抗凍性[16]。李明軍[13]等對懷地黃進行包埋玻璃化超低溫保存時低溫鍛煉5 d，存活率達66%；本研究表明，扁桃莖尖未經(jīng)低溫鍛煉的扁桃莖尖進行超低溫保存后莖尖存活率為0，經(jīng)過低溫鍛煉4周后可以提高扁桃超低溫保存后的成活率。但低溫鍛煉時間太長超過6周后，扁桃試管苗葉片逐漸枯黃、淡褐色的莖尖增多，從而降低了莎車18號扁桃莖尖超低溫保存后的存活率。

在預(yù)培養(yǎng)中單獨使用一種冰凍保護劑其保存效果不理想，很多報道研究發(fā)現(xiàn)采用復(fù)合冰凍保護劑的優(yōu)越性在于它能充分發(fā)揮各種成分的保護作用，從而產(chǎn)生累加效應(yīng)[17]，而本試驗用5%DMSO和0.3 mol/L蔗糖復(fù)合冰凍保護劑預(yù)培養(yǎng)1 d，存活率較高。預(yù)培養(yǎng)時間過短或過長對扁桃莖尖超低溫保存后存活率影響較大，本研究發(fā)現(xiàn)同一濃度的預(yù)處理液隨著預(yù)處理天數(shù)的增加，包埋丸中的扁桃莖尖褐變率增加，其原因可能是由于材料脫水過度、細(xì)胞產(chǎn)生了滲透脅迫所致。

在恢復(fù)培養(yǎng)時暗培養(yǎng)時間對扁桃莖尖的存活率有較大的影響。趙艷華等[18]發(fā)現(xiàn)在桃莖尖超低溫保存過程中，化凍后的莖尖通過15 d的暗培養(yǎng)后，可顯著提高其成活率，若直接在光下培養(yǎng)，成活率極低。本研究還發(fā)現(xiàn)，暗培養(yǎng)1周以內(nèi)，莖尖都是綠的，一旦轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)扁桃莖尖第二天就會變白；暗培養(yǎng)2周后，扁桃莖尖超低溫保存后存活率增加。有研究認(rèn)為,在恢復(fù)培養(yǎng)時需要提高激素濃度或添加新的激素成份，材料才能恢復(fù)正常生長[16]。在扁桃莖尖超低溫保存后恢復(fù)培養(yǎng)時，用繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)的扁桃莖尖存活率不高，為了提高莎車18號扁桃莖尖超低溫保存后的存活率，究竟暗培養(yǎng)要進行多長時間的，培養(yǎng)溫度多少和恢復(fù)培養(yǎng)基是什么，還有待進一步研究。

本試驗采用包埋玻璃化法超低溫保存扁桃莖尖, 保存后存活率還比較低，還需進一步對扁桃超低溫保存的程序和方法進行優(yōu)化，從而建立適合扁桃超低溫保存體系。

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