無(wú)血清誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向雪旺細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究

張秀霞，蔣良福

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院手外科，浙江 溫州 325027)

雪旺細(xì)胞作為周圍神經(jīng)組織工程的種子細(xì)胞在周圍神經(jīng)再生中的重要作用已被廣泛證實(shí)，誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向雪旺細(xì)胞的分化是目前研究的熱點(diǎn)，已有從骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為雪旺細(xì)胞的報(bào)道[1，2]。將誘導(dǎo)后的雪旺細(xì)胞作為種子細(xì)胞移植入的是一個(gè)無(wú)血管供血的體內(nèi)環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)將模擬體內(nèi)環(huán)境，探討在無(wú)血清培養(yǎng)下將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成雪旺細(xì)胞的可行性，為以后的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向雪旺細(xì)胞的體內(nèi)誘導(dǎo)分化提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 近交系SD大鼠10只，清潔級(jí)，體重180～200g，2月齡，雌雄不限，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑 0.1%Ⅰ型膠原酶(sigma，美國(guó))，10%胎牛血清(碧云天公司，杭州)，DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))，100X青鏈霉素，β-巰基乙醇(sigma，美國(guó))，全反式維甲酸(sigma，美國(guó))，forskolin(Peprotech，英國(guó))，堿式成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibrgblast growth factor，bFGF，Peprotech，英國(guó))，血小板源性衍生因子(platelet derived growth factor，PDGF，Peprotech，英國(guó))，神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子(glial growth factor，GGF，Peprotech，英國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng) 采用Zuk等[3]的方法分離大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞并培養(yǎng)。2個(gè)月齡SD大鼠麻醉后取雙側(cè)睪丸周圍脂肪組織，去除肉眼可見(jiàn)血管以及結(jié)

基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金資助(Y2100253)；溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(Y20130203)；*本文通訊作者：蔣良福

締組織，剪成約1 cm×1 cm×1 cm大小，0.1%Ⅰ型膠原酶震蕩消化60 min，等體積DMEM/F12終止消化，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，1 000 r/min離心10 min，去上清液，沉淀用含15%胎牛血清的DMEM/F12重懸并接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。48 h換液去除未貼壁細(xì)胞，每3天換液。取第三代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞行倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察、CD44、CD90和CD45流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志

1.2.2 分組 將第3代大鼠脂肪干細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組予無(wú)血清培養(yǎng)基(100%DMEM/F12)誘導(dǎo)培養(yǎng)，對(duì)照組繼續(xù)DMEM/F12完全培養(yǎng)基(90DMEM/F12+體積分?jǐn)?shù)10%FBS)誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2.3 大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向雪旺細(xì)胞誘導(dǎo)方法 將2組細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，吹打分散成單個(gè)細(xì)胞懸液后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，24 h后分別加入含1 mmol/Lβ-巰基乙醇的培養(yǎng)基，24 h后PBS清洗，加入含40 ng/mL全反式維甲酸的培養(yǎng)基，培育72 h去除培養(yǎng)基，PBS清洗，加入含5 ng/mL PDFG，10 ng/mL bFGF，14 μmol/L forsklin，200 ng/mL GGF的培養(yǎng)基中培育2周，期間3天換液一次。

1.3 觀察指標(biāo) 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞倒置顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞CD90和CD44、CD45流式鑒定。誘導(dǎo)形態(tài)觀察：誘導(dǎo)后2周倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。S-100和GFAP免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色：誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后細(xì)胞爬片，鋪滿后4%多聚甲醛固定，各組細(xì)胞封閉、一抗、二抗孵育，封片后倒置熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算陽(yáng)性率。

2 結(jié) 果

原代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞呈成纖維樣細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)。流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記，間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的CD90和CD44表達(dá)陽(yáng)性，而造血細(xì)胞相關(guān)的CD45表達(dá)陰性(見(jiàn)圖1～3)。2組第三代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后，大部分細(xì)胞成梭形，長(zhǎng)出兩極突起，突起帶有光暈，各相鄰細(xì)胞突起之間相互連接，成樹(shù)杈狀排列(圖4～5)。經(jīng)S-100和GFAP免疫熒光染色后，2組大量細(xì)胞的S-100和GFAP免疫熒光細(xì)胞染色陽(yáng)性，實(shí)驗(yàn)組S-100陽(yáng)性率(82.1±5.31)%，對(duì)照組S-100陽(yáng)性率(79.15±6.38)%，比較無(wú)明顯差異(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)組GFAP陽(yáng)性率(78.39±6.92)%，對(duì)照組GFAP陽(yáng)性率(80.51±3.29)%，比較無(wú)明顯差異(P>0.05)，(見(jiàn)圖6～9)。

3 討 論

雪旺細(xì)胞具有營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、趨化和使周圍神經(jīng)再生軸突成熟的重要功能，在修復(fù)周圍神經(jīng)缺失的過(guò)程中具有重要的作用。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞是近年來(lái)較熱門的種子細(xì)胞，人體脂肪組織含量豐富，容易提取，且大量研究表明脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能[4，5]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者都曾報(bào)道了將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成雪旺細(xì)胞的研究。但目前沒(méi)有模擬移植初期體內(nèi)的缺血環(huán)境，因此本實(shí)驗(yàn)用無(wú)血清的培養(yǎng)基模擬體內(nèi)的缺血環(huán)境，將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為雪旺細(xì)胞。

圖1 CD90流式細(xì)胞表型鑒定陽(yáng)性

圖2 CD44流式細(xì)胞表型鑒定陽(yáng)性

圖3 CD45流式細(xì)胞表型鑒定陰性

圖4 倒置顯微鏡下無(wú)血清培養(yǎng)誘導(dǎo)后雪旺細(xì)胞(×100)

圖5 倒置顯微鏡下含血清培養(yǎng)誘導(dǎo)后雪旺細(xì)胞(×100)

圖6 試驗(yàn)組S-100細(xì)胞免疫熒光(×100)

圖7 對(duì)照組S-100細(xì)胞免疫熒光(×100)

圖8 試驗(yàn)組GFAP細(xì)胞免疫熒光(×100)

雪旺細(xì)胞來(lái)源于神經(jīng)嵴細(xì)胞，再由神經(jīng)嵴細(xì)胞經(jīng)雪旺細(xì)胞前體、未成熟的雪旺細(xì)胞，最后發(fā)育為神經(jīng)細(xì)胞。β-巰基乙醇能提高細(xì)胞內(nèi)的c-AMP水平，適量濃度的β-巰基乙醇可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化[6]，全反式維甲酸能促進(jìn)早期的神經(jīng)細(xì)胞向神經(jīng)嵴細(xì)胞分化，同時(shí)能促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂[7，8]。PDFG，bFGF，forsklin，GGF是可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞向周圍神經(jīng)分化以及成熟，并提高對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的應(yīng)答的細(xì)胞因子，在使用全反式維甲酸誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞后，應(yīng)用PDFG，bFGF，forskllin，GGF，細(xì)胞體形更加兩極化，并出現(xiàn)光暈，成樹(shù)杈狀排列，符合雪旺細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。

圖9 對(duì)照組GFAP細(xì)胞免疫熒光(×100)

S100和GFAP是雪旺細(xì)胞富含的蛋白，是鑒定雪旺細(xì)胞的常用指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)在無(wú)血清培養(yǎng)條件下，采用逐步誘導(dǎo)的方法，將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞逐步誘導(dǎo)為雪旺細(xì)胞。經(jīng)細(xì)胞免疫熒光鑒定符合雪旺細(xì)胞特性，與血清培養(yǎng)條件下比較，在形態(tài)學(xué)和細(xì)胞免疫熒光鑒定陽(yáng)性率無(wú)明顯差異。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)條件下，能定向誘導(dǎo)分化為雪旺細(xì)胞。

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