呼吸道病毒核酸檢測技術(shù)的新進(jìn)展及其在臨床中的應(yīng)用

韋棟,張欣欣

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院臨床病毒研究室，上海 200025

呼吸道病毒主要包括流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)、腺病毒、鼻病毒等，目前其感染已成為全世界主要致死性因素之一。不論是在發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家，每年因呼吸道病毒感染而占用的醫(yī)療資源增加了政府的沉重負(fù)擔(dān)[1]。世界衛(wèi)生組織(World Health Orgnization，WHO)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，20世紀(jì)僅流感病毒便奪去了全世界1億人的生命，其中大部分是老人和兒童[2]。因此，如何在早期對(duì)呼吸道病毒感染作出準(zhǔn)確診斷一直是臨床面臨的難點(diǎn)。由于大多數(shù)呼吸道病毒感染表現(xiàn)出相似癥狀，臨床醫(yī)師很難僅根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)作出準(zhǔn)確診斷[3]。病毒分離培養(yǎng)是診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但獲得結(jié)果至少需3～5 d，難以對(duì)早期診斷和早期治療提供幫助。常用的快速檢測方法如免疫熒光分析(immunofluorescent assay, IFA)及酶免疫分析(enzyme immunoassay, EIA)雖有較高的特異度，但靈敏度不理想(利用抗體中和試驗(yàn)檢測H1N1感染的靈敏度只有50%左右)[4]。近幾年來，尤其是隨著幾種新型病毒﹝嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)、H5N1、H1N1、博卡病毒(bocavirus，BoV)等﹞被發(fā)現(xiàn)，人們迫切需要尋求一種更加快速、準(zhǔn)確的病毒檢測方法。

以聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)為代表的核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)在過去10年里飛速發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測，因此利用核酸檢測技術(shù)成為呼吸道病毒體外診斷的新方向[5]。核酸檢測技術(shù)在保證高靈敏度和特異度的基礎(chǔ)上，大大縮短了檢測時(shí)間，國際上圍繞其建立了多種較為成熟的呼吸道病毒檢測方法。本文就核酸檢測技術(shù)及其在目前常見呼吸道病毒感染中的相關(guān)應(yīng)用作一綜述。

1 現(xiàn)有核酸檢測技術(shù)

1.1 PCR

起源于1984年的PCR技術(shù)，為現(xiàn)代臨床分子檢測打下了基石。伴隨技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)PCR由于檢測時(shí)間過長、易污染、靈敏度及特異度不理想且無法準(zhǔn)確定量等原因，已逐漸被其衍生方法(如實(shí)時(shí)熒光定量PCR)所替代，在呼吸道病毒核酸檢測領(lǐng)域已不常用。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以傳統(tǒng)PCR技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，使核酸檢測從定性分析發(fā)展到定量分析，開創(chuàng)了核酸檢測分析的新局面。目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR已成為呼吸道病毒核酸檢測的最主要方法。

相對(duì)于傳統(tǒng)PCR，熒光定量PCR檢測呼吸道病毒有如下優(yōu)點(diǎn)：①定量檢測可隨時(shí)監(jiān)控病毒擴(kuò)增情況；②建立了一個(gè)封閉式反應(yīng)檢測環(huán)境，大大減少了交叉污染的可能性，同時(shí)具有很高的靈敏度及特異度[6]，且所需標(biāo)本量極??；③檢測時(shí)間較傳統(tǒng)PCR縮短。隨著技術(shù)發(fā)展，多重PCR可在一次反應(yīng)中同時(shí)檢測多個(gè)病原體甚至病毒亞型[7]，大大節(jié)約了成本及時(shí)間，但需特異性的反應(yīng)試劑和專門的檢測設(shè)備，因此很難在偏遠(yuǎn)地區(qū)和小型醫(yī)院普及。

1.3 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)(microarray technology)又稱基因微陣列，通過將已標(biāo)記的待測標(biāo)本與特異性排列的寡核苷酸序列雜交后，利用激光共聚焦收集雜交信號(hào)，從而完成對(duì)病原體的檢測。根據(jù)固定寡核苷酸序列載體性質(zhì)的不同，分為固相及液相芯片分析技術(shù)。利用固相基因芯片技術(shù)成功建立的呼吸道病毒檢測系統(tǒng)具有高通量特點(diǎn)，通過獲得病原體的全部信息可對(duì)病毒進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定和篩選，甚至發(fā)現(xiàn)新型病毒，這是傳統(tǒng)方法難以比擬的[8]。經(jīng)過多年發(fā)展，成熟商品化的固相芯片技術(shù)包括AutoGenomics的INFINITI Analyzer技術(shù)和Idaho Technology的FilmArray技術(shù)，兩者均可同時(shí)檢測15～17種呼吸道病毒[9,10]。

液相基因芯片技術(shù)的代表是Luminex公司所開發(fā)的微球懸浮陣列技術(shù)(又稱流式熒光檢測技術(shù))xMAP，基本原理是將特異性的基因探針與具有不同熒光信號(hào)的微球相交聯(lián)，待其與待測擴(kuò)增片段結(jié)合后，借助流式技術(shù)獲得相應(yīng)的病毒信息，達(dá)到快速、準(zhǔn)確定量分析。目前，Luminex的xTAG和Qiagen的ResPlexⅡ這2種商業(yè)化檢測技術(shù)已獲得美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)投入臨床使用，可在3 h內(nèi)檢測16～19種呼吸道病毒及其亞型[11]。

1.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

2000年，日本學(xué)者Notomi提出了一種全新的核酸擴(kuò)增技術(shù)——環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)。其借助3對(duì)特異性引物(涉及靶基因上6段不同的基因序列)進(jìn)行擴(kuò)增，在短時(shí)間內(nèi)即可獲得大量DNA擴(kuò)增片段[12]。由于具有6種引物，且必須在全部引物都結(jié)合于正確區(qū)域后擴(kuò)增才會(huì)進(jìn)行，因此LAMP具有極高的特異度；同時(shí)靈敏度達(dá)到PCR的10～100倍，病毒的最低檢測范圍可達(dá)0.01～10 PFU[10]。此外，LAMP擴(kuò)增只需保持65 ℃恒溫，省去了復(fù)雜的溫度控制設(shè)備及溫度調(diào)節(jié)過程，使檢測成本和時(shí)間均較PCR大幅下降。LAMP擴(kuò)增結(jié)果的觀察基本依靠產(chǎn)物的濁度分析。最便捷的方法是通過肉眼觀察擴(kuò)增管辨別陽性結(jié)果，也可在加入SYBR Green、鈣黃綠素(calcein)等染料后用紫外燈照射觀察結(jié)果，使用實(shí)時(shí)濁度儀(LA-200，Teramecs，Japan)則可對(duì)光密度(optical density，OD)值進(jìn)行半定量實(shí)時(shí)監(jiān)測[12]。

LAMP方法具有高特異度、高靈敏度、快速、低成本、無需特殊設(shè)備即可觀察結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，但引物設(shè)計(jì)復(fù)雜，其中2對(duì)長序列引物需達(dá)色譜純級(jí)別，且易被污染而影響檢測結(jié)果。但瑕不掩瑜，LAMP使得核酸診斷向床邊檢測(point-of-care testing，POCT)更進(jìn)了一步，十分適合基層快速診斷。

1.5 多重連接依賴的探針擴(kuò)增技術(shù)

多重連接依賴的探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)利用簡單的雜合、連接、PCR擴(kuò)增反應(yīng)，可對(duì)待測核酸靶序列進(jìn)行精確的定性和定量分析，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因診斷。MLPA最大的特色在于其針對(duì)靶序列設(shè)計(jì)了1對(duì)探針、1條化學(xué)合成的短探針及1條由M13噬菌體制備的長探針，擴(kuò)增僅針對(duì)完成連接的探針而非樣本靶序列。只有當(dāng)特異性探針與靶序列完全互補(bǔ)時(shí)，2條探針才能被連接酶連接形成單鏈擴(kuò)增，而每1對(duì)探針的擴(kuò)增產(chǎn)物長度都是唯一的，借助毛細(xì)電泳可對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離和鑒別，確保了其極高的特異度[13]。

目前歐洲已通過一種基于MLPA的檢測方法——RespiFinder assay，同時(shí)檢測包括流感病毒、副流感病毒、RSV、腺病毒在內(nèi)的15種呼吸道病毒，具有理想的靈敏度和特異度[14]。與其他分子診斷技術(shù)比較，MLPA較PCR和分離培養(yǎng)在靈敏度及特異度方面均有很大的優(yōu)勢，且操作簡單，重復(fù)性好，無需特殊設(shè)備，但在檢測時(shí)間方面優(yōu)勢不明顯，只能保證在24 h內(nèi)給出結(jié)果，無法作為快速診斷手段。

1.6 循環(huán)探針技術(shù)

循環(huán)探針技術(shù)(cycling probe technology)是一種高靈敏的核酸探針技術(shù)，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基礎(chǔ)上，巧妙地將DNA/RNA雜合探針與RNase H結(jié)合以達(dá)到檢測靶序列的目的[15]。循環(huán)探針是一種寡核苷酸，為DNA/RNA雜合體，其5′端為熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端是熒光淬滅基團(tuán)，內(nèi)部含有RNA堿基。當(dāng)探針完整時(shí)，可保持靜默狀態(tài)。在擴(kuò)增產(chǎn)物與探針互補(bǔ)結(jié)合后，RNase H會(huì)在探針RNA堿基處切斷探針，使熒光報(bào)告基團(tuán)釋放熒光信號(hào)。循環(huán)探針技術(shù)擁有很高的特異度，甚至能識(shí)別1個(gè)堿基的不同?；谶@一優(yōu)點(diǎn)，可用于研究單核苷酸多態(tài)性。

目前，有研究嘗試?yán)醚h(huán)探針技術(shù)檢測流感病毒耐藥株突變。與基因芯片等技術(shù)相比，循環(huán)探針技術(shù)更迅速，在保持了高特異度的基礎(chǔ)上大幅降低了成本，在流感耐藥株突變檢測方面有很高的實(shí)用性[16]。但目前未見其用于檢測其他病毒感染。

1.7 生物質(zhì)譜技術(shù)

近幾年來隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，越來越多的臨床實(shí)驗(yàn)室開始將質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于臨床檢測項(xiàng)目。在病原微生物檢測方面，具有極高分辨率的基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)無疑是一種有效的檢測手段。利用MALDI-TOF-MS對(duì)擴(kuò)增后的待測病毒PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，基于不同特異性核酸片段的差別，鑒別不同待測核酸序列的組成，再借助已有的病毒基因序列資料，可準(zhǔn)確鑒別出待測病原體[17]。

MALDI-TOF-MS的優(yōu)勢與潛力不言而喻，高度的分辨率與靈敏度、全自動(dòng)化的設(shè)備支持、隨著技術(shù)發(fā)展逐步縮短的檢測時(shí)間都是其亮點(diǎn)。目前，該方法可檢測的病毒種類也逐漸擴(kuò)展到RSV、副流感病毒、人類偏肺病毒(human metapneumovirus，HMPV)、冠狀病毒(coronavirus，CoV)、BoV等[17,18]。雖然其離真正成為常規(guī)檢測技術(shù)還需一段時(shí)間，但必將成為未來臨床實(shí)驗(yàn)室中病毒檢測的重要手段之一。

1.8 對(duì)未知呼吸道病毒的核酸檢測技術(shù)

呼吸道病毒的危險(xiǎn)性主要在于其暴發(fā)性及傳染性。2003年SARS暴發(fā)事件顯示，一種未知呼吸道病毒突然暴發(fā)所帶來的后果可能是災(zāi)難性的，因此如何在短時(shí)間內(nèi)更快、更準(zhǔn)確地檢測出新型病毒在臨床檢測中具有重要意義。由于現(xiàn)有的特異性免疫學(xué)及序列依賴的核酸檢測技術(shù)并不適用，研究者已開始建立非培養(yǎng)和非序列依賴的病原體檢測方法。常用技術(shù)包括非序列依賴的單引物擴(kuò)增技術(shù)(sequence-independent single primer amplification, SISPA)、隨機(jī)PCR技術(shù)(random PCR, rPCR)等。SISPA已用于檢測ssRNA病毒、dsRNA病毒及DNA病毒。rPCR通過在隨機(jī)引物的5′端添加一個(gè)通用序列后進(jìn)行2輪擴(kuò)增，具有比SISPA更高的檢測效率，已成功發(fā)現(xiàn)了新型BoV和CoV。最近，被稱為 次世代定序(next generation sequencing，NGS)[19]的具有高通量特征的序列分析檢測平臺(tái)也開始受到重視。相信隨著技術(shù)的不斷完善，快速、準(zhǔn)確鑒定新型病毒將不再是夢想。

2 應(yīng)用核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測呼吸道病毒

2.1 流感病毒

流感病毒是最常見的呼吸道病毒之一。A型流感病毒由于其血凝素(hemagglutinin，HA)基因及神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)基因極易發(fā)生基因漂移或重組，導(dǎo)致新型流感病毒暴發(fā)性感染，長期以來一直是全世界關(guān)注的一大公共衛(wèi)生問題。一般而言，流感病毒感染的典型臨床表現(xiàn)包括發(fā)熱、咳嗽、咽痛、鼻塞，以及頭痛、肌肉痛等，全年齡均可發(fā)病。由于許多呼吸道感染均可表現(xiàn)出流感樣癥狀，因此臨床醫(yī)師通常需借助實(shí)驗(yàn)室診斷來確診流感病毒感染。目前，我國流感病毒常用的病原學(xué)診斷方法包括血清學(xué)診斷和病毒培養(yǎng)，兩者靈敏度均較低。而臨床常用的2種抗流感病毒藥物——神經(jīng)氨酸酶抑制劑和M2離子通道抑制劑均須在患者感染后48 h內(nèi)用藥，這對(duì)流感病毒的病原學(xué)診斷提出了極高的要求。

核酸檢測技術(shù)為解決這一問題提供了新的途徑。自從1991年反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)首次成功用于檢測流感病毒以來， LAMP、核酸序列依賴性擴(kuò)增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)等多種分子檢測技術(shù)先后用于流感病毒的快速檢測。到目前為止，針對(duì)流感病毒的核酸檢測主要集中于3個(gè)靶基因序列，分別為M蛋白基因(M)、HA基因及非結(jié)構(gòu)蛋白基因(NSP)。一般而言，以保守M基因作為靶序列可檢測出所有A型流感病毒亞型。若希望對(duì)這些亞型進(jìn)行區(qū)分，則大多采用HA基因作為靶序列。在許多研究中，巢式PCR表現(xiàn)出較高的敏感度，但污染概率較高，故不宜作為臨床實(shí)驗(yàn)診斷的首選。

2.2 RSV

RSV是引發(fā)嬰幼兒支氣管炎及下呼吸道感染最重要的病原體之一[20]。RSV的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)通常包括病毒培養(yǎng)、免疫分析技術(shù)及核酸檢測。在核酸檢測中，一般以f、nc和polⅠ 基因作為靶序列[21, 22]。近幾年來隨著多重PCR技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了多種多重PCR方法，可準(zhǔn)確檢測RSV。以ResPlex Ⅱ(Qiagen, Germany)、Seeplex RV (Seegene, Korea)和xTAG RVP (Luminex, Canada)最具代表性，其中xTAG RVP首先通過美國FDA認(rèn)證，可同時(shí)檢測包括RSV在內(nèi)的12種呼吸道病毒。

值得一提的是，近年來部分研究開始嘗試將免疫PCR(immuno-PCR)技術(shù)應(yīng)用于RSV的實(shí)驗(yàn)室檢測[23]。免疫PCR將免疫檢測與核酸擴(kuò)增相結(jié)合，集PCR的高靈敏度及抗原抗體反應(yīng)的高特異度于一體。2011年一項(xiàng)研究顯示，使用免疫PCR檢測RSV可將最低檢測限降低至4 PFU/ml，達(dá)到一般RT-PCR靈敏度的4倍。但該技術(shù)目前尚未進(jìn)行臨床驗(yàn)證，其實(shí)際性能還有待商榷[24]。

2.3 腺病毒

腺病毒可導(dǎo)致發(fā)熱、咳嗽，同時(shí)可伴有咽喉炎、中耳炎、結(jié)膜炎、支氣管炎、哮喘和肺炎等癥狀。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在全部呼吸道感染中，1%～5%由腺病毒引發(fā)。對(duì)兒童而言，腺病毒導(dǎo)致呼吸道感染的比例攀升至2%～14%；尤其是幼年移植患者，腺病毒感染率可達(dá)22%，同時(shí)病死率達(dá)60%，因此有研究認(rèn)為應(yīng)將對(duì)腺病毒的定量PCR檢測作為兒科移植患者的重要監(jiān)測手段之一[25]。

目前，對(duì)腺病毒最靈敏的檢測技術(shù)為核酸檢測，適用的臨床標(biāo)本類型包括呼吸道、糞便、尿液及血液標(biāo)本。主要擴(kuò)增區(qū)域?yàn)楸Ｊ氐膆基因，也有將fiber或va(VA RNA)基因作為擴(kuò)增靶序列以達(dá)到進(jìn)一步分型的目的。以va基因?yàn)榘行蛄械腜CR檢測敏感度要高于以h基因?yàn)榘行蛄械臋z測方法。但無論如何，核酸擴(kuò)增檢測腺病毒的敏感度均優(yōu)于傳統(tǒng)的免疫分析或病毒培養(yǎng)技術(shù)。在多重PCR檢測領(lǐng)域，幾種主要的多重PCR方法均可檢測腺病毒，包括ResPlex Ⅱ、Seeplex RV 15、xTAG RVP等。2011年一項(xiàng)研究對(duì)750份呼吸道樣本進(jìn)行檢測，同時(shí)比較了4種不同的多重PCR檢測方法(ResPlex Ⅱ、Seeplex RV-15、xTAG RVP和xTAG RVP fast)[26]，結(jié)果顯示4種方法檢測腺病毒的敏感度差異很大(52.4%～100%)，其中Seeplex RV-15敏感度最高。當(dāng)然，敏感度的差異也有可能是由樣本抽選方法和腺病毒血清型不同導(dǎo)致的。

2.4 鼻病毒

長期以來，鼻病毒一直被認(rèn)為僅能引起普通感冒而未引起重視。但隨著核酸檢測技術(shù)的發(fā)展，越來越多的疾病被發(fā)現(xiàn)與鼻病毒相關(guān)。鼻病毒感染一般于每年春季及九月初達(dá)高峰，主要通過接觸和飛沫傳播。除普通感冒外，現(xiàn)已證明鼻病毒還與哮喘、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive lung disease，COPD)及嚴(yán)重的下呼吸道感染相關(guān)。其中人類鼻病毒遺傳群C(human rhinovirus species C，HRV-C)與哮喘和COPD的發(fā)病有十分密切的聯(lián)系[27,28]。

核酸檢測被認(rèn)為是最有效的實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)，通常以極度保守的5′-UTR區(qū)作為靶序列?，F(xiàn)已證明使用核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測鼻病毒的敏感度明顯高于傳統(tǒng)的病毒分離檢測。雖然以5′-UTR區(qū)作為檢測鼻病毒的靶序列最靈敏，但其無法將鼻病毒與人腸道病毒(human enterovirus，HEV)相區(qū)分[29]。這一缺陷可通過引入第2輪腸道病毒特異性PCR擴(kuò)增或以vp1/vp4基因作為靶序列來解決。在多重PCR領(lǐng)域，目前xTAG RVP檢測是唯一通過美國FDA認(rèn)證的、可用于檢測鼻病毒的多重PCR檢測方法。其他方法仍處于進(jìn)一步研究中，暫時(shí)無法確定其在鼻病毒檢測方面的臨床效果[30]。

2.5 H7N9禽流感病毒

H7N9禽流感病毒最初于2011年從禽類分離獲得，屬A型流感病毒[31]。但第1例人感染H7N9禽流感病毒病例于2013年2月在中國上海首先被發(fā)現(xiàn)，其后迅速波及中國多個(gè)省市，至2014年1月已累計(jì)出現(xiàn)200余例。臨床表現(xiàn)初期與普通流感相似，包括發(fā)熱、咳嗽、流涕、咽痛，伴頭痛或肌肉酸痛，可迅速進(jìn)展為重癥肺炎或呼吸衰竭。目前還未確定H7N9禽流感病毒的詳細(xì)傳播方式。

首例患者的H7N9禽流感病毒全長基因序列是借助“基因浮板跳躍”方法從原始患者標(biāo)本中分離獲得的，目前其最可靠的檢測方法是利用核酸檢測技術(shù)進(jìn)行病原學(xué)診斷[32]。檢測方法包括RT-PCR、LAMP等，檢測位點(diǎn)涵蓋M基因、HA基因及NA基因。部分研究證實(shí)，利用LAMP檢測H7N9禽流感病毒的特異度可達(dá)100%，敏感度亦高于普通RT-PCR，是一種非常有價(jià)值的快速篩查方法[33]。同時(shí)，也有研究人員基于對(duì)H7N9禽流感病毒的M基因建立了實(shí)時(shí)熒光RT-PCR快速篩查方法，但其實(shí)際臨床價(jià)值仍需進(jìn)一步研究[34]。加拿大的研究人員嘗試?yán)枚嘀豍CR檢測H7N9禽流感病毒，并與RT-PCR比較。結(jié)果表明，目前的主要多重PCR(ResPlex Ⅱ、xTAG RVP)在檢測H7N9禽流感病毒方面的敏感度及特異度均大大低于實(shí)時(shí)熒光RT-PCR[35]。因此，目前用多重PCR取代RT-PCR對(duì)H7N9禽流感病毒進(jìn)行篩查并不可取。

3 結(jié)語

分子診斷技術(shù)經(jīng)過多年發(fā)展，在不同原理的基礎(chǔ)上演變出多種病毒檢測技術(shù)。這些技術(shù)憑借快速、高敏感度、高特異度的優(yōu)勢，為快速診斷呼吸道病毒提供了切實(shí)有效的手段，并逐步取代分離培養(yǎng)，成為新一代的金標(biāo)準(zhǔn)。以核酸擴(kuò)增為主的分子診斷技術(shù)需在保持高敏感度和特異度的基礎(chǔ)上，向低成本、微型化、快速化方向發(fā)展，這樣不僅可在偏遠(yuǎn)地區(qū)和小型醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室中使用，還可應(yīng)用于床邊檢測領(lǐng)域，借助更快、更準(zhǔn)確的檢測技術(shù)，進(jìn)一步提高呼吸道感染預(yù)防、診斷、治療效率，使其致病率和致死率得到有效控制。

[1] Lozano R, Naghavi M, Foreman K, Lim S, Shibuya K, Aboyans V, Abraham J, Adair T, Aggarwal R, Ahn SY, et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010 [J]. Lancet, 2012, 380(9859): 2095-2128.

[2] Beck ET, Henrickson KJ. Molecular diagnosis of respiratory viruses [J]. Future Microbiol, 2010, 5(6): 901-916.

[3] Mahony JB. The clinical need for the RVP test [J]. J Clin Virol, 2007, 40(Suppl 1): S36-S38.

[4] Sandora TJ, Smole SC, Lee GM, Chung S, Williams L, McAdam AJ. Test characteristics of commercial influenza assays for detecting pandemic influenza A (H1N1) in children [J]. Pediatr Infect Dis J, 2010, 29(3): 261-262.

[5] Mahony JB. Nucleic acid amplification-based diagnosis of respiratory virus infections [J]. Expert Rev Anti Infect Ther, 2010, 8(11): 1273-1292.

[6] Liao RS, Tomalty LL, Majury A, Zoutman DE. Comparison of viral isolation and multiplex real-time reverse transcription-PCR for confirmation of respiratory syncytial virus and influenza virus detection by antigen immunoassays [J]. J Clin Microbiol, 2009, 47(3): 527-532.

[7] Sefers SE, Li H, Tang YW. Simultaneous detection and differentiation of respiratory syncytial virus and other respiratory viral pathogens [J]. Methods Mol Biol, 2011, 665: 309-323.

[8] Raymond F, Carbonneau J, Boucher N, Robitaille L, Boisvert S, Wu WK, De Serres G, Boivin G, Corbeil J. Comparison of automated microarray detection with real-time PCR assays for detection of respiratory viruses in specimens obtained from children [J]. J Clin Microbiol, 2009, 47(3): 743-750.

[9] Caliendo AM. Multiplex PCR and emerging technologies for the detection of respiratory pathogens [J]. Clin Infect Dis, 2011, 52(Suppl 4): S326-S330.

[10] Wu W, Tang YW. Emerging molecular assays for detection and characterization of respiratory viruses [J]. Clin Lab Med, 2009, 29(4): 673-693.

[11] Balada-Llasat JM, LaRue H, Kelly C, Rigali L, Pancholi P. Evaluation of commercial ResPlex II v2.0, MultiCode-PLx, and xTAG respiratory viral panels for the diagnosis of respiratory viral infections in adults [J]. J Clin Virol, 2011, 50(1): 42-45.

[12] Parida M, Sannarangaiah S, Dash PK, Rao PV, Morita K. Loop mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases [J]. Rev Med Virol, 2008, 18(6): 407-421.

[13] Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification [J]. Nucl Acids Res, 2002, 30(12): e57.

[14] Reijans M, Dingemans G, Klaassen CH, Meis JF, Keijdener J, Mulders B, Eadie K, van Leeuwen W, van Belkum A, Horrevorts AM, Simons G. RespiFinder: a new multi-parameter test to differentially identify fifteen respiratory viruses [J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(4): 1232-1240.

[15] Bekkaoui F, Poisson I, Crosby W, Cloney L, Duck P. Cycling probe technology with RNase H attached to an oligonucleotide [J]. Biotechniques, 1996, 20(2): 240-248.

[16] Suzuki Y, Saito R, Zaraket H, Dapat C, Caperig-Dapat I, Suzuki H. Rapid and specific detection of amantadine-resistant influenza A viruses with a Ser31Asn mutation by the cycling probe method [J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(1): 57-63.

[17] Deyde VM, Sampath R, Gubareva LV. RT-PCR/electro-spray ionization mass spectrometry approach in detection and characterization of influenza viruses [J]. Expert Rev Mol Diagn, 2011, 11(1): 41-52.

[18] Sampath R, Hall TA, Massire C, Li F, Blyn LB, Eshoo MW, Hofstadler SA, Ecker DJ. Rapid identification of emerging infectious agents using PCR and electrospray ionization mass spectrometry [J]. Ann NY Acad Sci, 2007, 1102: 109-120.

[19] Zhou X, Ren L, Meng Q, Li Y, Yu Y, Yu J. The next-generation sequencing technology and application [J]. Protein Cell, 2010, 1(6): 520-536.

[20] Stempel HE, Martin ET, Kuypers J, Englund JA, Zerr DM. Multiple viral respiratory pathogens in children with bronchiolitis [J]. Acta Paediatr, 2009, 98(1): 123-126.

[21] Blyth CC, Booy R, Dwyer DE. Point of care testing: diagnosis outside the virology laboratory [J]. Methods Mol Biol, 2011, 665: 415-433.

[22] Ginocchio CC, Swierkosz E, McAdam AJ, Marcon M, Storch GA, Valsamakis A, Juretschko S, Romero J, Yen-Lieberman B. Multicenter study of clinical performance of the 3M Rapid Detection RSV test [J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(7): 2337-2343.

[23] Perez JW, Vargis EA, Russ PK, Haselton FR, Wright DW. Detection of respiratory syncytial virus using nanoparticle amplified immuno-polymerase chain reaction [J]. Anal Biochem, 2011, 410(1): 141-148.

[24] Malou N, Raoult D. Immuno-PCR: a promising ultrasensitive diagnostic method to detect antigens and antibodies [J]. Trends Microbiol, 2011, 19(6): 295-302.

[25] Zaia J, Baden L, Boeckh MJ, Chakrabarti S, Einsele H, Ljungman P, McDonald GB, Hirsch H; Center for International Blood and Marrow Transplant Research; National Marrow Donor Program; European Blood and Marrow Transplant Group; American Society of Blood and Marrow Transplantation; Canadian Blood and Marrow Transplant Group; Infectious Disease Society of America; Society for Healthcare Epidemiology of America; Association of Medical Microbiology and Infectious Diseases Canada; Centers for Disease Control and Prevention. Viral disease prevention after hematopoietic cell transplantation [J]. Bone Marrow Transplant, 2009, 44(8): 471-482.

[26] Gharabaghi F, Hawan A, Drews SJ, Richardson SE. Evaluation of multiple commercial molecular and conventional diagnostic assays for the detection of respiratory viruses in children [J]. Clin Microbiol Infect, 2011, 17(12): 1900-1906.

[27] Traub S, Nikonova A, Carruthers A, Dunmore R, Vousden KA, Gogsadze L, Hao W, Zhu Q, Bernard K, Zhu J, Dymond M, McLean GR, Walton RP, Glanville N, Humbles A, Khaitov M, Wells T, Kolbeck R, Leishman AJ, Sleeman MA, Bartlett NW, Johnston SL. An anti-human ICAM-1 antibody inhibits rhinovirus-induced exacerbations of lung inflammation [J]. PLoS Pathog, 2013, 9(8): e1003520.

[28] Kurai D, Saraya T, Ishii H, Takizawa H. Virus-induced exacerbations in asthma and COPD [J]. Front Microbiol, 2013, 4: 293.

[29] Loens K, Goossens H, de Laat C, Foolen H, Oudshoorn P, Pattyn S, Sillekens P, Ieven M. Detection of rhinoviruses by tissue culture and two independent amplification techniques, nucleic acid sequence-based amplification and reverse transcription-PCR, in children with acute respiratory infections during a winter season [J]. J Clin Microbiol, 2006, 44(1): 166-171.

[30] Briese T, Palacios G, Kokoris M, Jabado O, Liu Z, Renwick N, Kapoor V, Casas I, Pozo F, Limberger R, Perez-Brena P, Ju J, Lipkin WI. Diagnostic system for rapid and sensitive differential detection of pathogens [J]. Emerg Infect Dis, 2005, 11(2):310-313.

[31] Bertran K, Pérez-Ramírez E, Busquets N, Dolz R, Ramis A, Darji A, Abad FX, Valle R, Chaves A, Vergara-Alert J, Barral M, H?fle U, Majó N. Pathogenesis and transmissibility of highly (H7N1) and low (H7N9) pathogenic avian influenza virus infection in red-legged partridge (Alectoris rufa) [J]. Vet Res, 2011, 42: 24.

[32] Gao R, Cao B, Hu Y, Feng Z, Wang D, Hu W, Chen J, Jie Z, Qiu H, Xu K, Xu X, Lu H, Zhu W, Gao Z, Xiang N, Shen Y, He Z, Gu Y, Zhang Z, Yang Y, Zhao X, Zhou L, Li X, Zou S, Zhang Y, Li X, Yang L, Guo J, Dong J, Li Q, Dong L, Zhu Y, Bai T, Wang S, Hao P, Yang W, Zhang Y, Han J, Yu H, Li D, Gao GF, Wu G, Wang Y, Yuan Z, Shu Y. Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus [J]. N Engl J Med, 2013, 368(20): 1888-1897.

[33] Ge Y, Wu B, Qi X, Zhao K, Guo X, Zhu Y, Qi Y, Shi Z, Zhou M, Wang H, Cui L. Rapid and sensitive detection of novel avian-origin influenza A (H7N9) virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral-flow device [J]. PLoS One, 2013, 8(8): e69941.

[34] Hackett H, Bialasiewicz S, Jacob K, Bletchly C, Harrower B, Nimmo GR, Nissen MD, Sloots TP, Whiley DM. Screening for H7N9 influenza A by matrix gene-based real-time reverse-transcription PCR [J]. J Virol Methods, 2014, 195: 123-125.

[35] Hatchette TF, Drews SJ, Bastien N, Li Y, German G, Antonishyn N, Charest H, Mazzulli T, Fonseca K, Krajden M, Petric M, Dust K, LeBlanc JJ. Detection of influenza H7N9 virus: all molecular tests are not equal [J]. J Clin Microbiol, 2013, 51(11): 3835-3838.