6 種miRNAs 在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血及關(guān)節(jié)液中的表達(dá)分析①

鄭錫銘 劉 鑫 周林林 張 濤 張愛君 徐廣賢 (寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗學(xué)院，銀川 750004)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜增生為主要特征的慢性自身免疫性炎癥疾病，主要病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)滑膜增厚并有大量炎癥細(xì)胞浸潤，血管翳形成以及軟骨的侵蝕與破壞［1］，有較高的致畸性和致殘性。miRNA 是一類短的內(nèi)源性非編碼RNA，通過抑制mRNA 的翻譯來調(diào)控機體蛋白表達(dá)［2］。miRNA 參與多種炎性和自身免疫性疾病的發(fā)病過程，且可能參與RA 新的調(diào)控機制［3，4］。研究發(fā)現(xiàn)，RA 患者滑膜組織和PBMC 中miR-155 和miR-146a 表達(dá)上調(diào)［5］，由于存在這些特異性miRNAs，人們提出miRNAs 可作為一種新型的特異性診斷標(biāo)志物［6］。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106、miR-130 可靶向調(diào)控TNF、IL-17、TLR-4、IRAK-1、IRAK-4等與RA 發(fā)病相關(guān)的基因(如圖1)，我們推測miRNAs 可通過靶向這些基因來參與調(diào)控RA 的發(fā)生發(fā)展。本研究檢測RA 患者外周血血漿、PBMC及關(guān)節(jié)液中miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106、miR-130 表達(dá)水平，并進(jìn)行臨床相關(guān)性分析，為RA 發(fā)病機制研究和臨床診斷提供新的思路。

1 材料及方法

1.1 研究對象 臨床樣本均來自寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院:RA 患者80 例為2013 年1～9 月住院病人，均符合ACR 1987 年修訂的診斷分類標(biāo)準(zhǔn)［6］，其中男20 例，女60 例，年齡21～71 歲，平均(46.6±11.5)歲。骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)患者32 例為醫(yī)院同期住院病人，符合1995 年美國風(fēng)濕病學(xué)會修訂的分類標(biāo)準(zhǔn)［7］，其中男12 例，女20 例，年齡26～75歲，平均(47.4± 12.7)歲。健康對照(Healthy controls，HC)32 例為同期健康體檢者，其中男10例，女22 例，年齡23～70 歲，平均(41.6±13.4)歲。選取的研究對象均排除其他自身免疫性疾病和重要器官系統(tǒng)疾病。未使用過糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑藥物治療。以上樣本的收集均獲得患者同意及寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會同意。

1.2 主要材料與試劑

1.2.1 Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液購自Sigma 公司;RNAiso for Small RNA 購自TaKaRa 公司;T1 Cloning Kit 試劑盒購自全式金公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid Fist Strand cDNA Synthesis Kit)、Top Green qPCR SuperMix 購自Thermo Scientific 公司;質(zhì)粒小提試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.2.2 引物的設(shè)計與合成 參考文獻(xiàn)設(shè)計stemloop 法檢測引物:莖環(huán)引物、Real-time PCR 上游引物;通用下游引物:5’-3’:CTCAACTGGTGTCGTGGA;以U6 作為內(nèi)參基因，根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中U6的成熟序列，設(shè)計其特異性引物，上游引物:CTCGCTTCGGCAGCAC;下 游 引 物:AACGCTTCACGAATTTGCGT。根據(jù)miRBase 數(shù)據(jù)庫miRNA成熟序列分別設(shè)計莖環(huán)引物(表1)特異檢引物(表2)，引物合成及DNA 測序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 方法

圖1 利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測與RA 相關(guān)的miRNAsFig.1 Use of bioinformatics software predicted miRNAs associated with RA

表1 莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物Tab.1 Primers used for reverse transcription

1.3.1 樣本收集，血漿、單個核細(xì)胞分離和small RNA 提取 空腹取靜脈血5 ml 于EDTA 抗凝管中，3 000 r/min，離心5 min 分離血漿，采取Ficoll 分離液分離PBMC;無菌收集病人關(guān)節(jié)液2 ml 于肝素抗凝管中。向分離的血漿、PBMC、關(guān)節(jié)液中加入1ml RNAiso 試劑，按照RNAiso for Small RNA 試劑盒說明書提取Small RNA，最后加入50 μl 的RNase-free水溶解沉淀。

1.3.2 cDNA 的合成 參照Thermo Scientific 反轉(zhuǎn)錄說明書，以small RNA 為模板，利用特異性莖環(huán)引物(見表1)，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件為42℃，60 min，70℃5 min。

1.3.3 T 載體的連接與標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 利用特異性上游引物(見表2)、通用下游引物各1 μl，模板cDNA 2 μl，進(jìn)行PCR 擴增。2.5% 瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段，參照T1 Cloning Kit 說明書將目的片段與T 載體連接。重組的miRNA-T 載體經(jīng)測序成功后，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍比稀釋，各取標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒2 μl 作為模板，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 miRNAs 表達(dá)量的檢測 利用qTOWER2.0 Real-time PCR 儀，采用Top Green qPCR SuperMix 反應(yīng)體系:Top Green qPCR SuperMix(2×)10 μl，PCR上游引物(10 μmol/L)1.0 μl，PCR 下游引物(10 μmol/L)1.0 μl，模板2 μl，補充RNase-free water 至20 μl。反應(yīng)程序為:95℃30 s，1 cycles;95℃5s，62℃30 s，72℃30 s，40 cycles;實驗設(shè)置3 個平行復(fù)孔，檢測結(jié)果取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用±s 表示，所有數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA 的擴增 small RNA 經(jīng)莖環(huán)引物反轉(zhuǎn)錄cDNA 后，PCR 產(chǎn)物經(jīng)2.5%的瓊脂糖凝膠電泳，條帶如圖2 所示。測序結(jié)果表明T 載體構(gòu)建正確，檢測結(jié)果表明small RNA、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 質(zhì)量可靠，可用于后續(xù)Real-time PCR 檢測。

表2 Real-time PCR上游檢測引物Tab.2 Forward primers used for qRT-PCR

2.2 血漿中miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106、miR-130 表達(dá)水平 RA 患者血漿miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106 和miR-130 表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，除miR-101RA 組與OA 組、OA 組與健康對照組外，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表3。

2.3 PBMC 中miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106、miR-130表達(dá)水平RA患者外周血PBMC 中miR-16、miR-17、miR-30a、miR-106 和miR-130 相對于OA 患者和健康對照組表達(dá)上調(diào);miR-101 相對于OA 患者表達(dá)下調(diào);OA 患者相對于健康對照組表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表4。

2.4 關(guān)節(jié)液中miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106、miR-130 表達(dá)水平 RA 組miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106、miR-130 表達(dá)量高于OA 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表5。

2.5 血漿、PBMC、關(guān)節(jié)液中miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106、miR-130 的相關(guān)性分析Pearsion 相關(guān)分析顯示，RA 組血漿與PBMC 中miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106、miR-130 正相關(guān)(r 依次為0.417、0.537、0.321、0.523、0.460、0.468，P＜0.05);血漿與關(guān)節(jié)液中miR-106 正相關(guān)(r=0.412，P＜0.05);PBMC 與關(guān)節(jié)液中miR-30a、miR-106、miR-130 正相關(guān)(r 依次為0.404、0.532、0.464，P＜0.05)，詳見表6。

圖2 miRNA PCR 擴增圖Fig.2 The results of PCR

表3 miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106、miR-130 表達(dá)水平(±s)Tab.3 List of miR-16，miR-17，miR-30a，miR-101，miR-106，miR-130 expression level ±s)

表3 miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106、miR-130 表達(dá)水平(±s)Tab.3 List of miR-16，miR-17，miR-30a，miR-101，miR-106，miR-130 expression level ±s)

Note:1)means RA group compared with the healthy control group P＜0.05;2)means RA group compared wtih OA group P＜0.05;3)means OA group compared with the healthy control group P＜0.05.

表4 miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106、miR-130 表達(dá)水平(±s)Tab.4 List of miR-16，miR-17，miR-30a，miR-101，miR-106，miR-130 expression level(±s)

表4 miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106、miR-130 表達(dá)水平(±s)Tab.4 List of miR-16，miR-17，miR-30a，miR-101，miR-106，miR-130 expression level(±s)

Note:1)means RA group compared with the healthy control group P＜0.05;2)means RA group compared wtih OA group P＜0.05;3)means OA group compared with the healthy control group P＜0.05.

表5 miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106、miR-130 表達(dá)水平(±s)Tab.5 List of miR-16，miR-17，miR-30a，miR-101，miR-106，miR-130 expression level(±s)

表5 miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106、miR-130 表達(dá)水平(±s)Tab.5 List of miR-16，miR-17，miR-30a，miR-101，miR-106，miR-130 expression level(±s)

表6 血漿、PBMC、關(guān)節(jié)液中miRNA 的相關(guān)性分析Tab.6 Correlation analysis of miRNA in plasma，PBMC and synovial fluid

2.6 血漿、PBMC、關(guān)節(jié)液中miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106、miR-130 與RF、CRP、ESR 的相關(guān)性分析 Pearsion 相關(guān)分析顯示，血漿中miR-16 與RF 正相關(guān)(r=0.372);miR-17、miR-101 與RF、ESR、CRP 正相關(guān)(r 依次為0.462、0.381、0.560、0.478、0.564、0、397)。PBMC 中miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-130 與RF 正相關(guān)(r 依次為0.478、0.496、0.444、0.426、0.592);miR-106 與CRP 正相關(guān)(r=0.440);miR-30a、miR-106與ESR 呈正相關(guān)(r=0.472、0.474)。關(guān)節(jié)液中miR-16、miR-17 與RF 正相關(guān)(r=0.215、0.283);miR-101 與CRP 正相關(guān)(r=0.330);miR-17、miR-101 與ESR 正相關(guān)(r=0.224、0.294)，詳見表7。

表7 血漿、PBMC、關(guān)節(jié)液中miRNA 與RF、CRP、ESR 的相關(guān)性分析Tab.7 Correlation analysis of plasma，PBMC，synovial fluid miRNA with RF，CRP and ESR

3 討論

RA 是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要特征，伴有關(guān)節(jié)外表現(xiàn)、全身表現(xiàn)的慢性自身免疫性疾病，目前該病發(fā)病機制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)miRNA 在RA發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用，有可能成為RA 新的診斷標(biāo)志物和治療靶點［8］。Murata 等［9］發(fā)現(xiàn)miR-16 在RA 患者的血漿或PBMC 中的表達(dá)量上調(diào)，并與28 關(guān)節(jié)疾病活動評分(DAS28)負(fù)相關(guān)，提示miR-16 可以作為RA 活動的分子標(biāo)志。Zhu 等［10］報道在RA 中miR-17、miR-106 通過靶向信號調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)調(diào)控巨噬細(xì)胞的浸潤，吞噬作用及促炎細(xì)胞因子的分泌。Li 等［11］發(fā)現(xiàn)，miR-30a 可以通過負(fù)調(diào)控REDD1 的表達(dá)調(diào)控成骨細(xì)胞的分化，而成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的比例失衡在RA 的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的意義。Zhang 等［12］發(fā)現(xiàn)miR-130 可以顯著上調(diào)T 細(xì)胞的活化，而T 細(xì)胞免疫功能的異常可能引起自身免疫性疾病的發(fā)生。由此可見，miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106、miR-130 與RA 是密切相關(guān)的，有望成為該病的診斷標(biāo)志物。

本研究表明，RA 組血漿中miR-16、miR-17、miR-30a、miR-106 和miR-130 相對于OA 患者和健康對照組表達(dá)上調(diào);RA 組miR-101 的水平與OA 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這些結(jié)果與Murata 等［9］報道相符。RA 組PBMC 中miR-16、miR-17、miR-30a、miR-106 和miR-130 相對于OA 組和健康對照組表達(dá)上調(diào);miR-101 相對于OA 組表達(dá)水平下調(diào)。同時發(fā)現(xiàn)這6 種miRNAs 在RA 組關(guān)節(jié)液中表達(dá)水平高于OA 組。Hunter 等［13］研究發(fā)現(xiàn)健康人PBMC 與血漿微泡中miRNA 表達(dá)方式明顯不同。Pearsion 相關(guān)性分析顯示，這6 種miRNAs 在血漿與PBMC 中正相關(guān);血漿與關(guān)節(jié)液中miR-106 正相關(guān);PBMC 與關(guān)節(jié)液 miR-30a、miR-106、miR-130 正相關(guān)，表 明miRNA 的表達(dá)方式較為復(fù)雜。RF、ESR、CRP 作為臨床常用的監(jiān)測RA 的活動性指標(biāo)，Pearsion 相關(guān)分析顯示，血漿中miR-16 與RF 正相關(guān);miR-17、miR-101 與RF、ESR、CRP 均正相關(guān)。PBMC 中miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-130 與RF 均正相關(guān);miR-30a、miR-106 與ESR 正相關(guān)。關(guān)節(jié)液中miR-16、miR-17 與RF 正相關(guān);miR-101 與CRP 正相關(guān);miR-17、miR-101 與ESR 正相關(guān)。這提示miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106、miR-130 的表達(dá)上調(diào)與RA 的病情活動性相關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106、miR-130 在RA 患者血漿、PBMC 及關(guān)節(jié)液中表達(dá)上調(diào)，可能通過與相關(guān)靶基因作用在RA 的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用;其表達(dá)水平可作為RA 疾病活動的有效指標(biāo)，也可作為RA 新的診斷指標(biāo)，但其在RA 發(fā)病機制中可能發(fā)揮的作用目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究，以便為RA的治療提供新的方向。

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