HE4 兩種融合蛋白的基因構(gòu)建和原核表達(dá)

張雪峰 劉一兵 李子穎 賈娟娟 王 斌 韓世泉

(原子高科股份有限公司，北京 102413)

卵巢癌是女性生殖器官常見(jiàn)的腫瘤之一，是嚴(yán)重威脅婦女生命和健康的疾病，其死亡率高于其他任何女性生殖系統(tǒng)腫瘤。70%以上卵巢癌病例就診時(shí)已為晚期，而晚期患者長(zhǎng)期生存率不超過(guò)25%［1，2］。如果卵巢癌患者能在早期被診斷、治療，其預(yù)后則非常理想。在Ⅰ期獲得診斷的卵巢癌，90%以上可通過(guò)手術(shù)和化療來(lái)治療且可達(dá)很好效果，但目前僅25%卵巢癌可以在Ⅰ期被發(fā)現(xiàn)。其中一方面原因是卵巢癌缺乏特異性的病狀體征，另一方面是缺乏有效的篩查方法。因此，提高卵巢癌的早期診斷水平、監(jiān)測(cè)其治療效果一直以來(lái)都是臨床醫(yī)生關(guān)注的熱點(diǎn)。

目前臨床上廣泛采用CA125 作為卵巢癌篩查和診斷的腫瘤標(biāo)志物，它對(duì)卵巢惡性腫瘤的早期診斷和病情監(jiān)測(cè)等有一定意義，但其臨床特異性及臨床靈敏度卻不夠理想。CA125 在癌癥早期表達(dá)的陽(yáng)性率僅為50%～60%，即使在中晚期卵巢腫瘤中也只有70%～80%［3，4］，2000 年，Hough 等［5］應(yīng)用基因表達(dá)大規(guī)模序列分析法證實(shí)HE4 基因是一種與卵巢癌相關(guān)的表達(dá)差異基因，提示HE4 可能作為新一代的卵巢癌診斷標(biāo)志物。2003 年，Hellstrom［6，7］及其同事從卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3 中提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增獲得HE4 基因，并開(kāi)展了一系列的后續(xù)研究。目前的研究表明，人附睪蛋白4(Human epididymis protein 4，HE4)作為新近提出的卵巢癌腫瘤標(biāo)志物，它在卵巢癌組織中高表達(dá)，而在癌旁組織、正常組織及良性腫瘤中水平較低［8］，檢測(cè)HE4 可能有助于卵巢惡性腫瘤的診斷、監(jiān)測(cè)及療效評(píng)估等［9，10］。本實(shí)驗(yàn)采用原核表達(dá)作為表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)重組蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，為將來(lái)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)HE4 免疫分析診斷試劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和菌株 人卵巢透明癌細(xì)胞ES-2購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，pEASY-Blunt Simple 克隆載體、Trans10 菌株和E.coli BL21 菌株購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。PET26b 和pGEX-4T-1 載體為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 工具酶和主要試劑 Trizol 試劑、DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma 公司。限制性?xún)?nèi)切酶EcoR Ⅰ、XhoⅠ、T4 連接酶購(gòu)自NEB 公司。RT-PCR 試劑盒、DNA 純化試劑盒購(gòu)自Promega 公司。凝膠回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司。GST 層析柱填料和鎳層析柱填料均購(gòu)自GE 公司。引物合成與測(cè)序由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成，引物序列為P1:5'-ACTGAGAATTCATGCCTGCTTGTCGCC-3'(含EcoRⅠ酶切位點(diǎn))和P2:5'-ATGCTCTCGAGTCAGAAATTGGGAGTGAC-3' (含Xho Ⅰ酶切位點(diǎn))［11］。胎牛血清購(gòu)自北京依科賽生物制品有限公司。HE4 酶聯(lián)免疫分析試劑盒購(gòu)自Fujirebio Diagnostis 公司。其他主要試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及RNA 提取 在5%CO2、37℃條件下，采用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)人卵巢透明癌ES-2 細(xì)胞株，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)采用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA。

1.4 RT-PCR 擴(kuò)增HE4 基因 采用Promega RTPCR 試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR 反應(yīng)體積為20 μl，其中2×Taq 聚合酶混合物10 μl、cDNA 3 μl、上下游引物各0.5 μl、滅菌水6 μl。PCR 反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行30 次循環(huán);最后72℃延伸6 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳驗(yàn)證，并用凝膠回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物。

1.5 HE4 基因重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建 將獲得的4 μl PCR 產(chǎn)物與1 μl pEASY-Blunt 載體質(zhì)粒連接構(gòu)建pEASY-Blunt-HE4 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)Trans10細(xì)菌中，均勻涂布于準(zhǔn)備好的含氨芐霉素抗性L(fǎng)B平板培養(yǎng)基上，IPTG 誘導(dǎo)，X-Gal 作為生色劑，過(guò)夜培養(yǎng)。挑取白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，取部分菌液并行抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切及測(cè)序鑒定。

1.6 HE4 基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 利用PET26b和pGEX-4T-1 質(zhì)粒分別作為載體構(gòu)建原核表達(dá)載體，采用限制性?xún)?nèi)切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ分別雙酶切pEASY-Blunt-HE4 質(zhì)粒、PET26b 和pGEX-4T-1。將凝膠回收得到的HE4 片段分別插入到酶切后的PET26b 和pGEX-4T-1 中。將重組質(zhì)粒PET26b-HE4 和pGEX-4T-1-HE4 分別轉(zhuǎn)化入感受態(tài)表達(dá)菌E.coli BL21 中，涂布于分別含有相應(yīng)抗性的LB 平板培養(yǎng)基上。過(guò)夜培養(yǎng)后，取菌液抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定。

1.7 HE4 融合蛋白的表達(dá) 分別對(duì)鑒定正確的PET26b-HE4 和PGEX-4T-1-HE4 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。取菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，待OD600nm 值達(dá)0.6～0.8 時(shí)加入IPTG 至終濃度為0.5 mmol/L，37℃誘導(dǎo)4 h，離心收集菌體，磷酸鹽緩沖液重懸菌體，經(jīng)超聲波破碎后，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。

1.8 表達(dá)產(chǎn)物的純化 按照1.7 項(xiàng)大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，取菌液，12 000 r/min 離心30 min，棄上清，將沉淀重懸于含0.5% TritonX-100、2.5 mmol/L二硫蘇糖醇、1.25 mmol/L L-半胱氨酸的平衡緩沖液中，4℃超聲裂解，收集可溶性蛋白，分別對(duì)GSTHE4 和His-HE4 使用GST 親和層析柱和鎳析柱進(jìn)行純化，洗脫、透析后，進(jìn)行12% SDS-PAGE 分析。

1.9 重組蛋白活性鑒定 采用HE4 酶聯(lián)免疫分析試劑盒對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行活性鑒定。將表達(dá)蛋白His-HE4 和GST-HE4 分別進(jìn)行稀釋?zhuān)勒赵噭┖姓f(shuō)明書(shū)對(duì)兩種表達(dá)蛋白進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 HE4 基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 以卵巢癌細(xì)胞總RNA 為模板，經(jīng)RT-PCR 擴(kuò)增出大小約為400 bp 的特異條帶，與預(yù)期相符，見(jiàn)圖1。

圖1 HE4 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of HE4 gene

2.2 重組克隆質(zhì)粒的鑒定 重組克隆質(zhì)粒pEASYBlunt-HE4 的雙酶切(EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)約400 bp 的目的基因條帶，見(jiàn)圖2。測(cè)序結(jié)果表明重組克隆質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 重組表達(dá)質(zhì)粒PET26b-HE4 和PGEX-4T-1-HE4 的雙酶切(EcoRⅠ/Xho Ⅰ)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)約400 bp 的目的基因條帶，見(jiàn)圖3。測(cè)序結(jié)果表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 重組菌PGEX-4T-1-HE4 的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)12% SDS-PAGE 分析，可見(jiàn)相對(duì)分子量約38 000 的特異蛋白條帶，重組蛋白GST-HE4主要以包涵體形式存在于破碎后的沉淀中，見(jiàn)圖4。重組菌PET26b-HE4 的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)12% SDSPAGE 分析，在相對(duì)分子量約12 000 處無(wú)明顯特異條帶，提示表達(dá)產(chǎn)量較低，圖略。

圖2 重組克隆質(zhì)粒的雙酶切(EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ)鑒定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid pEASYBlunt-HE4(EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ)

圖3 兩種重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切(EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ)鑒定Fig.3 Restriction map of recombinant plasmid PGEX-4T-1-HE4(EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ)and PET26b-HE4(EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ)

2.5 純化產(chǎn)物的鑒定 純化產(chǎn)物GST-HE4 經(jīng)12%SDS-PAGE 分析，在相對(duì)分子量約38 000 處可見(jiàn)明顯的特異性條帶，見(jiàn)圖5。純化重組蛋白GST-HE4的純度約為50%。

純化產(chǎn)物His-HE4 經(jīng)12% SDS-PAGE 分析，在相對(duì)分子量約12 000 處可見(jiàn)蛋白條帶，見(jiàn)圖6。純化重組蛋白His-HE4 的純度小于10%。

2.6 重組蛋白的活性鑒定 采用HE4 進(jìn)口酶聯(lián)免疫分析試劑盒對(duì)重組蛋白GST-HE4 和His-HE4 進(jìn)行活性鑒定，結(jié)果顯示，商品化試劑盒的兩株單克隆抗體可以特異識(shí)別表達(dá)產(chǎn)物GST-HE4 和His-HE4，并形成包被抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物。經(jīng)測(cè)定，純化產(chǎn)物GST-HE4 濃度為1.0 mg/ml，純化產(chǎn)物His-HE4 濃度為15 μg/ml。

圖4 GST-HE4 表達(dá)產(chǎn)物的SDA-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE profile of expressed GST-HE4 fusion protein

圖5 純化產(chǎn)物GST-HE4 的SDS-PAGE 分析Fig.5 SDS-PAGE profile of purified GST-HE4 fusion protein

圖6 純化產(chǎn)物His-HE4 的SDS-PAGE 分析Fig.6 SDS-PAGE profile of purified His-HE4 fusion protein

3 討論

HE4 作為一種新型的腫瘤標(biāo)志物，在臨床上已逐漸應(yīng)用于對(duì)卵巢癌的診斷及術(shù)后療效評(píng)估過(guò)程之中。本實(shí)驗(yàn)采用具有相同限制性酶切位點(diǎn)的兩種表達(dá)質(zhì)粒分別構(gòu)建了pGEX-4T-1-HE4 和PET26b-HE4兩種原核表達(dá)系統(tǒng)，并分別獲得了GST-HE4 和His-HE4 兩種原核表達(dá)蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組蛋白GST-HE4 在表達(dá)水平和表達(dá)蛋白可溶性方面要優(yōu)于His-HE4，且更易于純化。

原核表達(dá)HE4 蛋白相對(duì)分子量約為12 kD，而血清樣品中天然HE4 相對(duì)分子量約為20～25 kD，這是由于人體內(nèi)HE4 蛋白表達(dá)后糖基化修飾所致［12］。本實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫分析試劑盒鑒定表達(dá)蛋白活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示表達(dá)蛋白GST-HE4 和His-HE4 均可被商用試劑盒的兩株單克隆抗體識(shí)別。這說(shuō)明原核表達(dá)蛋白盡管在糖基化修飾方面存在缺點(diǎn)，但仍存在折疊正確的抗原表位，并且可與HE4單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合。

在未來(lái)的工作中，本實(shí)驗(yàn)獲得的原核表達(dá)蛋白將可用于HE4 單克隆抗體制備以及作為校準(zhǔn)品建立免疫分析方法。在抗體制備過(guò)程中，可采用純度相對(duì)較高的GST-HE4 作為免疫原進(jìn)行小鼠免疫，而采用His-HE4 對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選。兩種表達(dá)蛋白同時(shí)使用，將有利于篩選得到針對(duì)HE4 的特異性單克隆抗體。

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