IL-17 在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血表達(dá)的臨床意義

車昌燕 張國(guó)華 劉俊平 王明亮 (山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院，汾陽(yáng) 032200)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種發(fā)病機(jī)制尚不明確的以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主的自身免疫性疾病，細(xì)胞因子在慢性炎癥過(guò)程中起到重要作用［1］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Th17 是RA 重要的效應(yīng)T 細(xì)胞亞群［2］，而白細(xì)胞介素17(Interleukin-17，IL-17)是Th17 細(xì)胞產(chǎn)生的一種前炎性細(xì)胞因子，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用［3，4］，可能與RA 炎癥反應(yīng)、血管新生及關(guān)節(jié)滑膜病變之間存在一定的聯(lián)系。本研究通過(guò)從基因和蛋白水平檢測(cè)IL-17 在RA 患者和健康對(duì)照者外周血的表達(dá)并分析其與類風(fēng)濕因子(RF)的相關(guān)性，探討IL-17 與RA 發(fā)病及活動(dòng)性的關(guān)系，為RA 的發(fā)病機(jī)制研究和臨床治療提供新的理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 66 例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者均來(lái)自山西省汾陽(yáng)醫(yī)院門診或住院病人，均符合1987 年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ARA)制定的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男性24 例，女性42 例，年齡27～65 歲，平均(43.7±7.2)歲，疾病的活動(dòng)性用DAS28 評(píng)分來(lái)判斷，DAS28 ＞3.2 為活動(dòng)期組，共34 例;DAS28 ＜3.2 為緩解期組，共32 例。均排除高血壓、糖尿病、肝腎疾病、感染、腫瘤、心腦血管疾病和其他自身免疫性疾病等。對(duì)照組為42 例健康體檢者，其中男性14 例，女性28 例，年齡23～66 歲，平均(46.5±7.8)歲。各組患者年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本 采集所有研究對(duì)象空腹靜脈血2 管，第一管全血3 ml，置于肝素抗凝管中，用于IL-17 mRNA 的檢測(cè)。第二管無(wú)抗凝劑3 ml，靜置30 min，3 000 r/min 離心后取血清，分裝后置-70℃保存，用于血清IL-17 及RF 的檢測(cè)。

1.2.2 PBMC 中IL-17 mRNA 的檢測(cè) 采用密度梯度離心法分離PBMC，用無(wú)菌生理鹽水稀釋至細(xì)胞濃度為1 ×107ml-1。將分離的PBMC 中加入Trizol，按常規(guī)提取總RNA，測(cè)OD 值定量，以A260/A280、A260/A230 比值判斷RNA 樣品質(zhì)量，-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank 人IL-17 cDNA 序列設(shè)計(jì)引物，以β-actin 作為內(nèi)參照。IL-17 (172 bp):上游引物5'-GGCTGGAGAAGATACTGGTGT -3'，下游引物5'-TTTAGTCCGAAATGAGGCTGT-3'。β-actin (600 bp):上游引物5'-CACACTGTGCCCATCTACGA-3'，下 游 引 物 5'-CTGCTTGCTGATCCACATCT-3'。選用TaKaRa 公司的PrimeScript?One Step RT-PCR Kit Ver.2 試劑盒擴(kuò)增IL-17，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定PCR 反應(yīng)條件和最適循環(huán)數(shù)，以保證PCR產(chǎn)物量與起始mRNA 量呈線性相關(guān)。反應(yīng)結(jié)束后取5 μl PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像分析儀上觀察拍照，分析電泳條帶的光密度值，以β-actin 作內(nèi)參照，用相對(duì)光密度值［(IL-17 光密度值/β-actin 光密度值)× 100%］代表mRNA 的表達(dá)量。

1.2.3 血清IL-17 和RF 的檢測(cè) 采用上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)的ABC-ELISA 試劑盒檢測(cè)血清IL-17 表達(dá)水平，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，用Bio-Rad 伯樂(lè)酶標(biāo)儀680 于492 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定OD 值，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中IL-17的濃度。采用OLYMPUS 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清RF 表達(dá)水平，所用試劑為原裝配套試劑，檢測(cè)正常范圍＜14 U/ml。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用±s 表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，顯著性水準(zhǔn)P ＜0.05，各指標(biāo)間的相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson 相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 RA 患者和健康對(duì)照組PBMC 中IL-17 mRNA的表達(dá)水平 RT-PCR 結(jié)果顯示，健康對(duì)照組和RA患者組在172 bp 處都有條帶出現(xiàn)，但在RA 患者組的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于健康對(duì)照組，但RA 活動(dòng)期和緩解期患者PBMC 中IL-17 mRNA 的平均表達(dá)水平無(wú)明顯差別(圖1、表1)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

圖1 IL-17 mRNA 的RT-PCR 電泳分析Fig.1 RT-PCR electrophoresis analysis of IL-17 mRNA

表1 IL-17 mRNA 和血清IL-17 的表達(dá)水平(±s)Tab.1 Levels of IL-17 mRNA and serum IL-17(±s)

表1 IL-17 mRNA 和血清IL-17 的表達(dá)水平(±s)Tab.1 Levels of IL-17 mRNA and serum IL-17(±s)

Note:Compared with healthy control，1)P ＜0.05;compared with inactiveRA，2)P ＞0.05;compared with inactive RA，3)P ＜0.05.

表2 RA 患者體內(nèi)IL-17 與RF 的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis of IL-17 and RF in RA patients

2.2 RA 患者和健康對(duì)照組血清IL-17 的表達(dá)水平 ELISA 結(jié)果顯示RA 活動(dòng)期患者血清IL-17 的表達(dá)明顯高于RA 緩解期患者和健康對(duì)照組(表1)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。

2.3 RA 患者血清IL-17 與RF 的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示:RA 患者血清中IL-17 含量與RF 的表達(dá)呈正相關(guān)(P ＜0.05)(表2)。

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種累及周身關(guān)節(jié)為主的自身免疫性疾病，其病理特征是慢性炎癥細(xì)胞(T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)浸潤(rùn)和多種細(xì)胞因子分泌，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜漸進(jìn)性損傷和骨質(zhì)破壞［1］，其病因及發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。現(xiàn)在免疫機(jī)制越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外專家的關(guān)注，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)RA 患者體內(nèi)多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)異常表達(dá)，它們之間通過(guò)相互作用，相互調(diào)節(jié)形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，可能直接或間接參與了RA 的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程［5，6］。

IL-17 主要由Th17 細(xì)胞產(chǎn)生，是含有一個(gè)N-末端信號(hào)肽的155 個(gè)氨基酸的糖蛋白，是一種重要的前炎性細(xì)胞因子，與機(jī)體許多炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。IL-17 能刺激成纖維細(xì)胞分泌IL-6、IL-8 和GM-CSF 等炎癥因子，并能抑制軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)，增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，最終導(dǎo)致骨破壞［7］。有研究顯示在RA 患者關(guān)節(jié)滑膜及滑膜液中有大量的IL-17 表達(dá)［8］，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)在佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型早期，腹股溝淋巴結(jié)中IL-17 表達(dá)已升高，膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射腺病毒IL-17 可促進(jìn)小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生［9］，阿巴西普(abatacept)是臨床治療RA 的新藥物，已有研究顯示RA 患者經(jīng)阿巴西普治療后外周血中IL-17 的水平明顯降低［11］，說(shuō)明IL-17 在RA 的發(fā)病中具有重要作用。

DAS28 評(píng)分是一種有效地評(píng)價(jià)RA 疾病活動(dòng)程度的指標(biāo)，我們依據(jù)DAS28 評(píng)分將RA 患者分組，比較兩組間及二者與健康對(duì)照組外周血PBMC 中IL-17 mRNA 和血清IL-17 的表達(dá)水平，研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，RA 患者外周血PBMC 中IL-17 mRNA 和血清IL-17 的表達(dá)均顯著升高，提示IL-17 可能作為炎性細(xì)胞因子參與了RA 的發(fā)病過(guò)程。值得注意的是，活動(dòng)期RA 患者與緩解期RA 患者外周血PBMC 中IL-17 mRNA 的表達(dá)無(wú)明顯差別，但活動(dòng)期RA 患者血清IL-17 的表達(dá)顯著高于緩解期RA 患者，可能是在活動(dòng)期RA 患者體內(nèi)某些因素激發(fā)了IL-17 mRNA 的表達(dá)，導(dǎo)致血清IL-17 水平的增高，表明血清IL-17 的表達(dá)水平與RA 的疾病活動(dòng)性有關(guān)，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。Pearson 相關(guān)性分析顯示血清IL-17 表達(dá)水平與RF 表達(dá)成正相關(guān)，表明IL-17 可能是導(dǎo)致RA 炎癥發(fā)展和骨破壞的重要因素，通過(guò)檢測(cè)IL-17 可以間接觀察RA進(jìn)展和疾病活動(dòng)程度，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

IL-17 有多種生物學(xué)作用，因此其參與RA 發(fā)病的機(jī)制也可能是多方面的，進(jìn)一步深入研究IL-17與RA 的關(guān)系，將有助于對(duì)RA 發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，合理地評(píng)價(jià)RA 的病情進(jìn)展，為RA 的臨床診治提供新的思路。

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