甲狀腺乳頭狀癌患者血清、癌組織中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 的表達(dá)及臨床意義①

孫勤暖 李冬梅 吳 罡 屠 軍 云 芬 徐曉艷 于慧玲

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)病理教研室，呼和浩特 010059)

甲狀腺腫瘤是人類頭頸部疾病中的常見病和多發(fā)病，而甲狀腺乳頭狀腺癌是甲狀腺腫瘤中最常見的惡性腫瘤，約占甲狀腺癌的60%～70%，但我們對(duì)其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制知之甚少［1］。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素的生物學(xué)行為，其發(fā)生發(fā)展可能與眾多癌基因、抑癌基因有關(guān)，因此探索不同基因在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)情況，有助于我們更好地了解其發(fā)生機(jī)制及指導(dǎo)臨床治療［2］。目前國內(nèi)外對(duì)甲狀腺乳頭狀癌的研究在逐漸地深入，但對(duì)其發(fā)生機(jī)制尚不清楚，因此找到甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展的分子標(biāo)記物，是早期診斷甲狀腺乳頭狀癌的關(guān)鍵。本研究采用酶聯(lián)免疫學(xué)分析、免疫組織化學(xué)技術(shù)及分子生物學(xué)技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)凋亡因子:p53、Fas、TNFα 和Cyclin E 在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)，探討p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 能否成為甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展的分子標(biāo)記物，以利于提高甲狀腺乳頭狀癌早期診斷率，同時(shí)探討其與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移關(guān)系，為指導(dǎo)甲狀腺癌臨床診斷及判斷預(yù)后提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 隨機(jī)選擇內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2012 年4 月至2013 年8 月，經(jīng)穿刺確診為甲狀腺乳頭狀癌的住院患者74 例作為實(shí)驗(yàn)組［癌組織74 例及對(duì)應(yīng)的癌旁組織74 例，男29 例、女45 例，平均年齡(40.3±3.6)歲］、同期體檢健康人26 例作為正常對(duì)照組［男12 例、女14 例，平均年齡(37.9±2.4)歲］。癌癥患者全部排除其他器官瘤變，具有可比性。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和主要儀器 兔抗人p53、Fas、TNFα 和Cyclin E 多克隆抗體均購于Santa Cruz 公司;SP 免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB 顯色試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)有限公司;p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E ELISA 試劑盒購于南京建成生物有限公司;Trizol、引物、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒均購于北京鼎國生物有限公司。Leica RM 2245石蠟切片機(jī)(德國)、Leica HI1210 撈片機(jī)(德國)、LEICA HI1220 攤片機(jī)(德國);LEICA EG1150 包埋機(jī)(德國);Biotek Epoch 酶標(biāo)儀(美國);實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(型號(hào)ABI7300，美國);Biometra PCR 擴(kuò)增儀(美國);OLYMPUS BX51(日本)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 血清、癌旁正常組織和癌組織中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 蛋白含量的測(cè)定 采用ELISA 方法檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒操作。

1.3.2 癌旁正常組織和癌組織中p53、Fas、TNF-α和Cyclin E 蛋白陽性強(qiáng)度的測(cè)定 采用免疫組織化學(xué)方法，常規(guī)石蠟切片，4 μm，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，DAB 顯色后，用蘇木精復(fù)染，封片。光鏡下觀察見棕黃色為陽性表達(dá)，結(jié)果分析采用Motic Images Advanced 3.2 圖像分析系統(tǒng)測(cè)灰度值，灰度值越低，蛋白含量越高。

1.3.3 癌組織中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 蛋白陽性率的測(cè)定 分析p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的臨床分期、病理類型及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。在200 倍鏡下觀察全片，按陽性細(xì)胞所占百分比及著色程度進(jìn)行結(jié)果判定［3］。按陽性細(xì)胞比例判定:陽性細(xì)胞＜10% 計(jì)1 分，10%～50%計(jì)2 分，＞50%計(jì)3 分。按染色程度判定:陰性為0 分，淡黃色為1 分，中度黃色2 分，棕黃色3 分。按(陽性細(xì)胞得分×染色程度)得分計(jì)總分，總分＜3 分為陰性，≥3 分為陽性。

1.3.4 癌旁正常組織和癌組織中p53、Fas、TNF-α和Cyclin E 的基因表達(dá)的檢測(cè) 引物序列由北京鼎國生物有限公司合成。P53:Sense:5'-GAAGCAGTAAGTCAGGAGGGTT-3'，Antisense:5'-GGAAGGTTCTAGGCTGGAGG-3'，產(chǎn)物254 bp;FAS:Sense:5'-TGTGATGAAGGGCATGGTTT-3'，Antisense:5'-TTGGTGTTGCTGGTTCGTG-3'，產(chǎn) 物 176 bp;TNF-α:Sense:5'-GGTGATCGGTGCCAACAAGGA-3'，Antisense:5'-CACGCTGGCTCAGCCACTG-3'，產(chǎn)物173 bp;Cyclin E:Sense:5'-CCACCTCCATCACCACTACCA-3'，Antisense:5' -CCATTCCAACCAGAGCCACC-3'，產(chǎn)物136 bp。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，血清、癌旁正常組織和癌組織中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 的檢測(cè)結(jié)果均以±s 表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 血清、癌旁正常組織和癌組織中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 蛋白含量的比較 術(shù)前，實(shí)驗(yàn)組患者血清中p53、Fas 和TNF-α 的蛋白含量明顯低于正常對(duì)照組，Cyclin E 的蛋白含量明顯高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01);術(shù)后，實(shí)驗(yàn)組患者血清中p53、Fas 和TNF-α 的蛋白含量低于正常對(duì)照組，Cyclin E 的蛋白含量高于正常對(duì)照組，差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見表1。實(shí)驗(yàn)組患者癌組織中p53、Fas 和TNF-α 的蛋白含量明顯低于癌旁正常組織，Cyclin E 的蛋白含量明顯高于癌旁正常組織，差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見表2。

2.2 癌旁正常組織和癌組織中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 蛋白陽性強(qiáng)度的比較 光學(xué)顯微鏡觀察:免疫組織化學(xué)染色陽性部位為細(xì)胞質(zhì)染為棕黃色，細(xì)胞核用蘇木精復(fù)染為藍(lán)色。實(shí)驗(yàn)組患者癌組織中p53、Fas 和TNF-α 的蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度明顯低于癌旁正常組織，Cyclin E 的蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度明顯高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見表3 及圖1、2。

2.3 癌旁正常組織和癌組織中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 基因水平的比較 實(shí)驗(yàn)組患者癌組織中p53、Fas 和TNF-α 的基因水平明顯低于癌旁正常組織，Cyclin E 的基因水平明顯高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見表4。

表1 手術(shù)前后兩組血清中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 蛋白含量的比較(±s)Tab.1 Comparison of two groups p53，F(xiàn)as，TNF-α and Cyclin E protein content in serum before and after operation(±s)

表1 手術(shù)前后兩組血清中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 蛋白含量的比較(±s)Tab.1 Comparison of two groups p53，F(xiàn)as，TNF-α and Cyclin E protein content in serum before and after operation(±s)

Note:1)P ＜0.01，2)P ＜0.05 compared with normal control group;3)P ＜0.01 compared with before.

表2 癌旁正常組織、癌組織中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E蛋白含量的比較(±s)Tab.2 Comparison of p53，F(xiàn)as，TNF-α and Cyclin E protein content in normal para cancer tissue and cancer tissue(±s)

表2 癌旁正常組織、癌組織中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E蛋白含量的比較(±s)Tab.2 Comparison of p53，F(xiàn)as，TNF-α and Cyclin E protein content in normal para cancer tissue and cancer tissue(±s)

Note:1)P ＜0.01 compared with normal para cancer tissue.

表3 癌旁正常組織、癌組織中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E蛋白陽性強(qiáng)度的比較(±s)Tab.3 Comparison of p53，F(xiàn)as，TNF-α and Cyclin E protein positive strength in normal para cancer tissue and cancer tissue(±s)

表3 癌旁正常組織、癌組織中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E蛋白陽性強(qiáng)度的比較(±s)Tab.3 Comparison of p53，F(xiàn)as，TNF-α and Cyclin E protein positive strength in normal para cancer tissue and cancer tissue(±s)

Note:1)P ＜0.01 compared with normal para cancer tissue.

圖1 p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×200)Fig.1 Expression of p53，F(xiàn)as，TNF-α and Cyclin E in thyroid papillary carcinoma (immunohistochemical staining，×200)

圖2 p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 在癌旁正常組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×200)Fig.2 Expression of p53，F(xiàn)as，TNF-α and CyclinE in normal tissues adjacent to cancer (immunohistochemical staining，×200)

表4 癌旁正常組織、癌組織中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E基因水平的比較Tab.4 Comparison of v53，F(xiàn)as，TNF-α and Cyclin E gene level in normal para cancer tissue and cancer tissue(±s)

表4 癌旁正常組織、癌組織中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E基因水平的比較Tab.4 Comparison of v53，F(xiàn)as，TNF-α and Cyclin E gene level in normal para cancer tissue and cancer tissue(±s)

Note:1)P ＜0.01 compared with normal para cancer tissue.

2.4 癌組織中p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 蛋白陽性率與臨床病理特征關(guān)系的測(cè)定 p53、Fas、TNF-α和Cyclin E 蛋白陽性表達(dá)率與甲狀腺乳頭狀癌臨床分期、病理類型和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有明顯相關(guān)性(P ＜0.01);p53、Fas、TNF-α 均隨著病變的加重表達(dá)減少，而Cyclin E 隨著病變的加重表達(dá)增多，見表5。

表5 p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E 的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床特征的關(guān)系Tab.5 Relationship between clinical features and expression of thyroid papillary carcinoma p53，F(xiàn)as，TNF-α and Cyclin E

3 討論

甲狀腺癌是近20 年發(fā)病率增長最快的實(shí)體惡性腫瘤，年均增長6.2%［4］。大多數(shù)甲狀腺腫瘤應(yīng)用組織病理學(xué)和細(xì)胞學(xué)檢查能做出診斷，但有些甲狀腺腫瘤的良惡性不易區(qū)分，用常規(guī)檢查難以做出明確分類，此時(shí)需應(yīng)用一些新技術(shù)(如免疫組織化學(xué)、細(xì)胞和分子遺傳學(xué)技術(shù))輔助診斷，區(qū)分腫瘤不同的生物學(xué)行為，以避免過度治療和保證及時(shí)有效治療［5］。細(xì)胞凋亡又稱程序性死亡，是在某些生理和病理?xiàng)l件下，細(xì)胞主動(dòng)參與自身有一定程序的死亡過程，近年來細(xì)胞凋亡與腫瘤的關(guān)系日益密切，從基因?qū)W角度探討腫瘤發(fā)生發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移的機(jī)制已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)［6，7］。

已有研究證實(shí)，細(xì)胞凋亡及其調(diào)控基因異常是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一［8，9］，多種基因參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，其中包括p53、Fas、TNF-α 和Cyclin E等基因，凋亡不僅存在于正常組織，也存在于腫瘤組織，因此在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療中起著重要作用。Fas 抗原是人體多種細(xì)胞表面的一種膜蛋白，是一種觸發(fā)凋亡的蛋白質(zhì)，它屬于腫瘤壞死因子/神經(jīng)生長因子受體家族;當(dāng)它與Fas 配體或抗Fas 抗體結(jié)合時(shí)誘導(dǎo)凋亡［10］。TNF-α 是一個(gè)多效性的細(xì)胞因子，由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，廣泛參與細(xì)胞反應(yīng)，包括發(fā)熱、休克、組織損傷以及腫瘤壞死等效應(yīng)，并誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)因子參與細(xì)胞增生、分化與凋亡。TNF-α 與癌細(xì)胞表面受體結(jié)合成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞并與溶酶體融合，在TNF-α 的作用下溶酶體裂解釋放蛋白酶類導(dǎo)致細(xì)胞自溶［11，12］。Cyclin E 是一種核蛋白，Cyclin E 的表達(dá)受細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，并在G1 期末達(dá)到高峰。Cyclin E 在許多人類腫瘤中存在高表達(dá)，它能特異性地與細(xì)胞周期依賴激酶(CDK2)結(jié)合形成Cyclin E/CDK2 復(fù)合物，可以使底物磷酸化，釋放轉(zhuǎn)錄因子，使細(xì)胞通過起始點(diǎn)進(jìn)入S 期。在異常情況下，Cyclin E 過度表達(dá)存在于整個(gè)細(xì)胞周期中并持續(xù)地激活CDK2，底物磷酸化持續(xù)進(jìn)行［13，14］。p53 基因作為腫瘤抑制基因已被人們熟知，它分為兩型:一型是使細(xì)胞周期停止在G1 期，抑制細(xì)胞繁殖的野生型;一型是具有突變能力的變異型［15］。野生型p53 可誘導(dǎo)易感細(xì)胞發(fā)生凋亡、捕獲G1 周期，引起p53 激活與DNA 修復(fù)有關(guān)或凋亡的相關(guān)基因如TNF-α 和Fas，大量資料表明p53 因阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而達(dá)到抗癌作用;而變異型p53基因則無此功能，因此缺失p53 誘導(dǎo)的凋亡可能是轉(zhuǎn)化為腫瘤的重要因素之一［16］。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明:甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展與p53、Fas、TNF-α 基因的下調(diào)和Cyclin E 基因的上調(diào)密切相關(guān)，p53 的缺失進(jìn)一步誘導(dǎo)了Fas、TNF-α 的低表達(dá)和Cyclin E 的高表達(dá)，繼而促進(jìn)細(xì)胞異常增殖、腫瘤形成。四種蛋白的陽性表達(dá)率與甲狀腺乳頭狀癌臨床分期、病理類型和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有明顯相關(guān)性，提示p53、Fas、TNF-α和Cyclin E 可能在甲狀腺乳頭狀癌浸潤和轉(zhuǎn)移中起重要作用，四者的聯(lián)合檢測(cè)可成為判斷預(yù)后和指導(dǎo)臨床用藥的指標(biāo)。

［1］朱雄增.甲狀腺癌診治相關(guān)的病理學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國實(shí)用外科雜志，2010，30(10):889-891.

［2］徐 璇，于世鵬.生長分化因子-15 在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及意義［J］.中國免疫學(xué)雜志，2014，30 (4):468-471.

［3］杜華貞，張延新，李維山，等.Kiss-1 與TIMP-1 在胃癌中的表達(dá)及臨床病理意義［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2008，24(3):374-377.

［4］阿勒哈，孟慶彬，于健春，等.甲狀腺癌分子發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，35(4):382-385.

［5］彭 茜，安振梅.甲狀腺癌分子生物學(xué)研究進(jìn)展［J］.華西醫(yī)學(xué)，2014，29(2):368-373.

［6］Fukahori M，Yoshida A，Hayashi H，et al.The associations between RAS mutations and clinical characteristics in follicular thyroid tumors:new insights from a single center and a large patient cohort［J］.Thyroid，2012，22(7):683-689.

［7］Ding WX，Manley S，Ni HM.The emerging role of autophagy in alcoholic liver disease［J］.Exp Biol Med(Ma-ywood)，2011，236(5):546-556.

［8］馮真真，夏海濱.細(xì)胞凋亡相關(guān)分子與腫瘤基因治療［J］.生命的化學(xué)，2009，29(5):705-710.

［9］曹 妍，王大南，孫 玥，等.抗癌藥SN38 通過脂筏促進(jìn)Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［J］.中國免疫學(xué)雜志，2012，28(7):603-607.

［10］王 強(qiáng)，楊志雄，廖思海.Fas、FasL 和Caspase-3 在肺癌中的表達(dá)及其臨床意義［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2009，17(2):248-251.

［11］張磊磊.腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體抗腫瘤作用研究進(jìn)展［J］.中華實(shí)用診斷與治療雜志，2013，27(7):629-631.

［12］李 濤，陳正望.TNF-α 在腫瘤中的作用［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，11(18):3586-3588.

［13］楊正平.Cyclin E/Cdks 復(fù)合物相關(guān)調(diào)控分子與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.實(shí)用腫瘤學(xué)雜志，2008，22(2):185-188.

［14］鮑正齊，肖玉周，張長春，等.Cyclin E 和p27 蛋白在骨肉瘤中的表達(dá)及臨床意義［J］.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2013，22(2):161-166.

［15］Lu C，El-Deiry WS.Targeting p53 for enhanced radio and chemosensi-tivity［J］.Apoptosis，2009，14(4):597-606.

［16］Guan YS，Liu Y，Zou Q，et al.Adenovirus-mediated wild-type p53 gene transfer in combination with bronchial arterial infusion for treatment of advanced non-small-cell lung cancer，one year followup［J］.J Zhejiang Univ Sci B，2009，10(5):331-340.