川芎嗪對小鼠哮喘模型Th17 細胞的調(diào)控作用以及對Th17、Treg 細胞平衡的影響

姜 暉 陳霞霞 王金艷 薛云飛 (河北省唐山市工人醫(yī)院藥劑科，唐山 063000)

支氣管哮喘是一種慢性的呼吸系統(tǒng)疾病，嚴重威脅人類的健康［1，2］。近年來，支氣管哮喘在世界各國的發(fā)病率均有上升，且兒童的哮喘患病率也逐年攀升，支氣管哮喘已逐漸成為嚴重危害成人與兒童健康的公共衛(wèi)生問題。但是目前的研究尚未能完全闡明哮喘的發(fā)病機制［3，4］。研究表明，支氣管哮喘是由嗜酸性粒細胞、肥大細胞以及T 淋巴細胞等多種細胞共同參與的一種氣道炎癥。各種細胞在氣道內(nèi)聚集，進而釋放細胞因子以及炎癥介質(zhì)引起氣道功能發(fā)生障礙。而T 淋巴細胞在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。Th17 細胞以及Treg 細胞是獨立的CD4+T 細胞亞群，Th17 細胞主要通過分泌IL-17來發(fā)揮免疫作用，在炎性反應(yīng)以及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。而Treg 細胞通過與其他細胞直接接觸和/或分泌一些抑制性的細胞因子如TGF-β、IL-10 等發(fā)揮免疫負調(diào)控的作用［5］，通過Treg 細胞功能的發(fā)揮，可以控制效應(yīng)T 細胞的反應(yīng)強度，從而防止過度免疫反應(yīng)對機體造成的病理損害。

川芎嗪是一種在臨床應(yīng)用已久的中藥，其具有作用靶點多、副作用小，在治療哮喘方面療效確切的優(yōu)點［6，7］，但是其在哮喘中的作用機制尚不清楚［8，9］，本研究通過建立小鼠哮喘模型，觀察川芎嗪對小鼠Th17、Treg 細胞的影響，探討川芎嗪在治療哮喘中的機制，以期進一步為臨床治療哮喘提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物以及動物模型建立 雄性BALB/c 小鼠40 只，6～8 周齡，體重為22～24 g。隨機將小鼠分成四組，分別為正常對照組、哮喘模型組、川芎嗪治療組以及激素治療組，其中哮喘模型組、川芎嗪治療組以及激素治療組在第0、7、14 天給予含0.1%OVA 的0.1 ml Al(OH)3腹腔注射，并在第21 天開始用含2%的OVA 生理鹽水溶液10 ml 進行霧化吸入30 min;川芎嗪治療組小鼠在第0、7、14 天以及每次霧化吸入前30 min 腹腔注射川芎嗪80 mg/kg;激素治療組小鼠在第0、7、14 天以及每次霧化吸入前30 min 腹腔注射地塞米松注射液0.5 mg/kg;正常對照組用生理鹽水替代OVA 進行腹腔注射以及霧化吸入。

1.2 標本收集 眼球取血后處死小鼠，取200 μl加PBS 稀釋至3 ml，緩慢加入至小鼠淋巴細胞分離液上，保持分層，4℃、1 500 r/min、10 min，取中間白色的淋巴細胞層，用3 ml PBS 重懸后離心，棄上清。其余的血液靜置2 h 后離心，4℃、2 000 r/min、15 min，取上層血清分裝保管于-80℃冰箱。解剖小鼠后，取左下肺葉，用10%的甲醛固定后，脫水、石蠟包埋、切片，常規(guī)HE 染色。

1.3 ELISA 測定血清中IL-17、IL-10 的水平 按照ELISA 試劑盒說明書進行檢測血清中IL-17、IL-10的水平，用酶標儀在450nm 處測定OD 值。

1.4 流式細胞儀檢測Th17 細胞、Treg 細胞比例 心臟灌洗后取小鼠肺組織剪成約3 cm ×2 cm 的小塊，用IV 型膠原酶在37℃消化3 h，過膜后4℃、2 750 r/min× g，7 min，percoll 離心，棄上清，加入40%細胞后，4℃、2 000 r/min，20 min，取中間的一層細胞用PBS 洗2 遍，離心棄上清后計數(shù)取稀釋的細胞懸液，每管含1 ×106個細胞，分別加入CD4、CD25、IL-17 抗體或者CD4、CD25 抗體，破膜固定后加入FoxP3 抗體，混勻后避光孵育30 min，加3 ml PBS，4℃、1 500 r/min、5 min，棄上清，用500 μl 2%的多聚甲醛固定后待測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS11.5 統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)用±s 表示，組間比較采用方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組小鼠的癥狀觀察 在每次致敏和霧化吸入后，觀察四組小鼠的癥狀，發(fā)現(xiàn)在第1 次致敏后，各組小鼠表現(xiàn)無差異。在第2 次致敏后，哮喘模型組、川芎嗪治療組及激素治療組小鼠出現(xiàn)伏地不動和毛發(fā)豎起的現(xiàn)象，而正常對照組小鼠未發(fā)現(xiàn)上述現(xiàn)象。在霧化吸入后，哮喘模型組小鼠出現(xiàn)呼吸急促、鼻翼煽動、煩躁不安、反應(yīng)遲鈍、排泄物增多等現(xiàn)象。川芎嗪治療組及激素治療組小鼠表現(xiàn)較輕微，僅有活動減慢、精神輕度萎靡的現(xiàn)象，正常對照組小鼠活動良好。

2.2 四組小鼠的肺組織病理檢查 各組小鼠組織切片HE 染色后在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常對照組小鼠肺部紋理致密，未見炎癥細胞。哮喘模型組小鼠支氣管管腔變小，管壁增厚，并且肺泡間隙增寬，在支氣管和小血管周圍發(fā)現(xiàn)大量的嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞浸潤。而治療組小鼠的肺組織切片中僅發(fā)現(xiàn)少量的炎性細胞，見圖1。

2.3 四組小鼠外周血中Th17 細胞以及Treg 細胞比例 通過流式細胞儀分析四組小鼠外周血中Th17 細胞和Treg 細胞占總CD4+T 細胞的比例發(fā)現(xiàn)，正常對照組小鼠的Treg 細胞以及Th17 細胞的比例為正常范圍，哮喘模型組小鼠的Treg 細胞較正常組小鼠比例明顯降低，而Th17 細胞占CD4+T 細胞顯著升高;川芎嗪治療組小鼠以及激素治療組小鼠的變化趨勢一致，Treg 細胞以及Th17 細胞的比例趨于正常，見圖2、3。

2.4 ELISA 測定血清中IL-17、IL-10 的水平 IL-17是Th17 細胞主要分泌的細胞因子，而IL-10 是Treg細胞發(fā)揮抑制作用的主要細胞因子。通過ELISA法檢測各組小鼠血清中的IL-17、IL-10 的水平，發(fā)現(xiàn)正常對照組小鼠血清中IL-17 以及IL-10 的水平在正常范圍內(nèi)，分別為(10.21±2.11)、(57.37±3.29)ng/ml，而哮喘模型組小鼠的IL-17 的水平達到了(23.6±2.19)ng/ml 顯著高于正常對照組小鼠(t=13.283，P=0.000)，IL-10 的水平為(17.38±4.62)ng/ml 較正常對照組小鼠顯著降低(t=11.748，P=0.000)，川芎嗪治療組小鼠的IL-17 水平為16.22±2.37 ng/ml 較哮喘模型組小鼠明顯降低(t=9.462，P=0.000)，而IL-10 的水平為40.27±1.28 ng/ml顯著升高(t=11.374，P=0.000)，激素治療組小鼠的變化趨勢與川芎嗪治療組小鼠一致，見圖4。

圖1 四組小鼠的肺組織HE 染色(光學(xué)顯微鏡，×200)Fig.1 Mice lung tissue HE staining of four groups(Optical microscope，×200)

圖2 Treg 細胞以及Th17 細胞占CD4 +T 細胞比例的流式圖Fig.2 Flow chart of Treg cells and Th17 cells accounted for proportion of CD4 +T cells

圖3 Treg 細胞以及Th17 細胞占CD4 +T 細胞比例的統(tǒng)計圖Fig.3 Statistical chart of Treg cells and Th17 cells accounted for proportion of CD4 +T cells

圖4 血清中IL-17、IL-10 的水平Fig.4 Level of serum IL-10 and IL-17

3 討論

支氣管哮喘是一種常見的以氣道高反應(yīng)性和可逆性氣道阻塞為主要特征的變態(tài)反應(yīng)性疾病。支氣管哮喘會導(dǎo)致氣道反應(yīng)增高，氣道黏膜細胞會分泌大量的黏液，出現(xiàn)不可逆的氣流受限［10］。在支氣管哮喘的病理過程中，有多種細胞如肥大細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞以及T 淋巴細胞等都參與了炎癥反應(yīng)。研究表明，氣道的高反應(yīng)性與Th1 細胞受到抑制以及Th2 細胞功能亢進有關(guān)［11，12］，但是近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Th1 細胞與Th2 細胞的失衡不能解釋所有的發(fā)病機制。大量的研究表明，Th17 細胞和Treg 細胞在支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著非常重要的作用［13］。

川芎嗪是一種從中藥川芎中提取出來的一種生物堿，川芎嗪有活血化瘀、祛風(fēng)止痛、行氣的功效。研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪是一種鈣離子拮抗劑，可以明顯抑制不同因素引起的平滑肌細胞的鈣離子內(nèi)流，可能與影響氣道重建有關(guān)［14，15］。研究發(fā)現(xiàn)在豚鼠的哮喘模型中，川芎嗪可以提高外周血中Treg 細胞的比例，對由Th2 細胞介導(dǎo)的呼吸道變應(yīng)性炎癥發(fā)揮強大的抑制效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示川芎嗪能夠明顯地減少OVA 誘導(dǎo)哮喘小鼠模型肺組織中Th17 細胞占CD4+T 細胞的比例以及IL-17 的表達水平，其機制可能是通過促進Treg 細胞的生長、增殖以及IL-10等抑制性細胞因子的分泌預(yù)防或控制哮喘的發(fā)生。

本研究設(shè)立了生理鹽水誘導(dǎo)的正常小鼠作為陰性對照組，致敏原OVA 誘導(dǎo)的哮喘模型組，川芎嗪治療的小鼠以及激素治療的陽性對照組。通過觀察小鼠的癥狀、肺組織的病理圖片以及各組小鼠外周血中Th17 細胞以及Treg 細胞比例以及血清中IL-17、IL-10 的水平，發(fā)現(xiàn)小鼠哮喘模型的Treg 細胞受到明顯抑制而Th17 細胞的比例升高，誘導(dǎo)過程中給予川芎嗪及地塞米松治療組，可以有效地阻止這種變化，從而減輕哮喘的癥狀，預(yù)防/控制哮喘發(fā)生，為有效控制支氣管哮喘發(fā)作提供有效的治療途徑。

本研究結(jié)果提示川芎嗪可以通過增強Treg 細胞的功能，增加Treg 細胞的數(shù)量，進而抑制Th17 細胞的數(shù)量以及功能，減輕Th17 細胞的應(yīng)答，降低IL-17 細胞因子的分泌，達到預(yù)防/控制哮喘發(fā)生、減輕哮喘癥狀的療效。

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