油茶內生拮抗細菌Y13的定殖能力及其對土著細菌的影響

王瑞芹 周國英 劉君昂 李冬琴 孟慶敏

（中南林業(yè)科技大學 經濟林培育與保護教育部重點實驗室，長沙 410004）

油茶內生拮抗細菌Y13的定殖能力及其對土著細菌的影響

王瑞芹 周國英 劉君昂 李冬琴 孟慶敏

（中南林業(yè)科技大學 經濟林培育與保護教育部重點實驗室，長沙 410004）

采用抗利福平標記法，定期取樣、平板稀釋法回收等方法，檢測拮抗菌株Y13在油茶葉片內的定殖能力；以平板培養(yǎng)及16S rDNA法分析菌株Y13對油茶葉片內土著細菌種群的影響，為油茶炭疽病的生態(tài)治理提供理論依據。結果表明，菌株Y13在油茶健株和病株葉內均能穩(wěn)定定殖，接種30 d時仍分別能檢測到6.60×103CFU/g和3.56×103CFU /g的標記菌株；油茶葉片內可培養(yǎng)內生細菌主要屬于5個屬的7個已知種，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、鞘氨醇菌屬（Sphingomonas）和假單胞菌屬（Pseudomonas），以芽孢桿菌屬和賴氨酸芽孢桿菌屬為優(yōu)勢屬。菌株Y13對不同處理油茶葉片內的群落結構和數量有明顯的影響，能促進土著細菌群體的多樣性，同時能夠顯著提高油茶葉片內的枯草芽孢桿菌數量，有利于抑制油茶炭疽病病原菌的增長。

油茶炭疽病 內生拮抗細菌 定殖 土著細菌

油茶炭疽?。–olletotrichum gloeosporioides）是油茶的主要病害，在我國油茶產區(qū)普遍發(fā)生，引起嚴重落果、落蕾、落葉、枝枯，甚至整株衰亡，嚴重制約了油茶的產量［1］。目前，對炭疽病的防治主要以化學防治為主，但大量化學藥劑的使用對人畜產生一定的毒害且造成嚴重的環(huán)境污染，同時會導致病原菌抗藥性的產生。國內外已有不少關于利用內生細菌來防治植物病害的報道［2-6］。馬英元等［7］利用內生拮抗細菌Mg15來防治甜瓜白粉病，防治效果顯著；美國Agraquest公司［8］將生防菌株枯草

芽胞桿菌QST713制成生物農藥，可以用于防治多種植物病害，是一種廣譜生物殺菌劑。因此，利用植物內生細菌防治植物病害已成為研究的熱點。

拮抗細菌Y13是從健康的油茶葉上分離篩選得到的一株對油茶炭疽病具有良好防治效果的內生細菌，經鑒定該菌株為Bacillus subtilis［9］。本文主要研究Y13菌株在油茶健株和病株葉內的定殖，以及對土著細菌群體影響，了解內生拮抗細菌Y13、土著細菌以及油茶炭疽病原菌三者之間的相互作用，為油茶病害高效生防菌劑的開發(fā)與應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 油茶炭疽病病原菌：油茶膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），為中南林業(yè)科技大學森林保護實驗室分離保存；Y13菌株和Y13R突變菌株：Y13菌株經鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），為中南林業(yè)科技大學森林保護實驗室分離保存；Y13R菌株是利福平（Rifampicin）300 μg/mL的抗性突變體，該突變體在培養(yǎng)性狀和對油茶炭疽病菌的抑菌效果與Y13菌株是一致的［10］。

1.1.2 供試作物及品種 油茶：1年生健康油茶，品種為湘林1號。

1.2 方法

1.2.1 接種體的制備 Y13R懸浮液：取保存于4℃的Y13R菌株，在含利福平濃度為300 μg/mL NA抗性平板上活化，取單菌落接種于NB液體培養(yǎng)基中，30℃過夜培養(yǎng)24 h，再以5% 接種量轉接于NB培養(yǎng)液中，30℃、180 r/min 震蕩培養(yǎng)72 h，離心后收集菌體，用無菌水稀釋至濃度為109CFU/mL。

油茶炭疽病原菌孢子懸浮液：將含0.1%吐溫-80的無菌水注入長滿油茶炭疽病原菌的PDA平板中，沖洗病原菌孢子，用血球計數板計數后稀釋成孢子數為106個/mL的懸浮液。

1.2.2 油茶苗接種處理試驗 試驗共設4個處理：H1為油茶健株對照（噴無菌水）；H2為油茶病株對照（僅接種油茶炭疽病病原菌）；H3為接種Y13R菌液的油茶健株（僅接種Y13R懸浮液）；H4為接種Y13R菌液的油茶病株（同時接種油茶炭疽病病原菌和Y13R菌液）。接種采用刺傷葉片法，用無菌針頭刺傷油茶苗葉片，然后分別將Y13R懸浮液和油茶炭疽病原菌孢子懸浮液噴到不同處理的油茶刺傷葉片上，接種用量均為10 mL/株，然后進行套袋保濕24 h。每處理10株油茶苗，每個處理設3個重復，共120株。自接種第2天開始，每天噴水1-2次，直至試驗全部結束。

1.2.3 取樣和回收方法 分別于接種后3、6、10、15、20和30 d進行取樣。細菌的回收采用平板梯度稀釋法。剪取不同處理接種的油茶植株葉片約0.5 g，沖洗干凈，將樣品剪成小的組織塊，放入75%酒精浸30 s，再用3%次氯酸鈉消毒2-3 min，用無菌水沖洗4次，取最后一次沖洗液0.1 mL均勻涂布于NA培養(yǎng)基，觀察有無菌落產生，檢驗葉片表面是否滅菌徹底。然后將表面滅菌徹底的組織塊放入已滅菌的研缽中，加入少量滅菌的石英砂，再加入5 mL PBS緩沖液（NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40. 24 g，蒸餾水1 000 mL），研磨成勻漿，用PBS緩沖液進行梯度稀釋。為回收Y13R菌株，取0.2 mL稀釋液涂布于含利福平濃度為300 μg/mL 的NA培養(yǎng)基上，同時使用不含任何抗生素的NA培養(yǎng)基分離樣品中的土著細菌。每個稀釋液設3個重復，28℃下培養(yǎng)36 h，然后進行平板計數。

1.2.4 油茶內生細菌的分離純化與保存 根據土著細菌菌落形態(tài)特征和鏡檢菌體形態(tài)，對土著細菌進行初步分類，然后挑取有差異的代表性菌株，在NA平板上劃線分離、純化，4℃貯藏備用。

1.2.5 油茶內生細菌的分子鑒定 將純化好的菌株接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，30℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)24 h。按照細菌基因組DNA提取試劑盒（DP-302）操作說明提取菌株基因組DNA。細菌16S rDNA序列擴增方法：選取細菌通用引物，27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'，擴增細菌的16S rDNA保守序列?？侾CR反應體系為25 μL：模板1 μL，引物27F 1 μL，引物1492R 1 μL，2×PCR master mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將PCR產物陽性結果的樣品送至上海博尚生物技術有線公司

測序。測序結果在GenBank中進行同源性比對。

1.2.6 優(yōu)勢菌種的確定 根據微生物鑒定和計數結果計算各種土著細菌的相對分離頻率，若相對分離頻率大于10%，則確定該菌株為優(yōu)勢菌。

某菌株相對分離頻率（%）=某菌株的菌落數/分離的微生物總菌落數×100%

2 結果

2.1 拮抗細菌Y13R在油茶健株和油茶病株葉內的定殖動態(tài)

采用刺傷葉片法，均能從接種Y13R的油茶健株（H3）和油茶病株（H4）葉片內回收到標記菌株，而對照組未檢測到標記菌株，說明標記菌株Y13R能在油茶葉片內定殖。標記菌株Y13R在油茶健株和油茶病株葉片內的定殖動態(tài)如表1所示。

表1 標記菌株Y13在油茶葉片內的定殖動態(tài)（CFU/g）

菌株Y13R在油茶健株葉片內的定殖動態(tài)，如表1所示。接種3 d后，菌株Y13R在油茶健株葉片內的定殖密度為5.15×104CFU/g，是同時期菌株Y13R在油茶病株上的29.94倍，差異達到顯著性水平（P＜0.05）；之后迅速減少，到接種第10 d時，定殖密度最小為2.43×103CFU /g，之后逐漸上升，接種20 d后，定殖密度為8.65×103CFU /g，之后趨于平衡，接種30 d時仍能檢測到6.60×103CFU /g的標記菌株。

菌株Y13R在油茶病株葉片內的定殖動態(tài)如表1所示。接種3 d后，菌株Y13R在油茶病株葉片內的定殖密度為1.72×103CFU/g，接種6 d后，菌株Y13R定殖密度比油茶健株高，為8.68×103CFU/g，接種15 d后，達到最大值1.61×104CFU/g，之后逐漸下降，接種20 d后，定殖密度為4.69×103CFU/g，之后趨于平衡，接種30 d時仍能檢測到3.56×103CFU /g的標記菌株。以上表明標記菌株Y13R在油茶葉片內的定殖能力強，定殖時間長達30 d以上。

2.2 拮抗細菌Y13對油茶葉片內細菌菌群的影響

2.2.1 菌株Y13對不同處理油茶葉片內總的細菌群體數量分析 不同處理的油茶葉片內總的細菌群體數量差異較大，見圖1。從圖1中可以看出，油茶健株（H1）葉片內總內生細菌數量波動較小，平均值為3.99×103CFU/g。接種油茶炭疽病病原菌后，油茶病株（H2）葉片內細菌群體數量高于油茶健株，相差1.12-26.68倍。

接種菌株Y13R的油茶健株（H3）葉片內總細菌群體數量高于油茶健株對照，相差1.33-19.15倍；接種3 d后，接種菌株Y13R的油茶病株（H4）葉片內總細菌群體數量為8.10×104CFU/g，是油茶病株對照的2.63倍，之后總細菌群體數量逐漸降低，到接種20 d時，接種菌株Y13R的油茶病株（H4）葉片內總細菌群體數量達到最大值為9.84×104CFU /g，是油茶病株對照的2.39倍。以上表明不同處理的油茶葉片內總的細菌群體數量差異較大，菌株Y13能夠提高油茶葉片內總細菌群體數量。

圖1 不同處理油茶葉片內總內生細菌數量變化

2.2.2 菌株Y13對油茶葉片內可培養(yǎng)內生細菌類群分析 對油茶葉片內可培養(yǎng)內生細菌的16S rDNA 序

列相似性進行比對分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見表2。從分析結果看，不同處理油茶葉片內可培養(yǎng)內生細菌主要屬于5個屬的7個已知種，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、鞘氨醇菌屬（Sphingomonas）和假單胞菌屬（Pseudomonas），以芽孢桿菌屬和賴氨酸芽孢桿菌屬為優(yōu)勢屬。

表2 油茶可培養(yǎng)內生細菌 16S rDNA 序列相似性分析

由圖2可知，油茶健株（H1）可培養(yǎng)內生細菌主要屬于3個已知屬，其中芽孢桿菌屬細菌最多，占81.85%，為優(yōu)勢屬，包含4個已知種，其次是賴氨酸芽孢桿菌屬，占16.91%，為優(yōu)勢屬，包含1個已知種，最少的為鞘氨醇芽孢桿菌屬，僅占1.25%；油茶病株（H2）葉片內可培養(yǎng)內生細菌與油茶健株（H1）有3種共有的已知屬，克雷伯菌屬為油茶病株（H2）所特有的屬，占17.71%，為其優(yōu)勢屬；接種Y13R的油茶健株（H3）與油茶健株（H1）有3種共有的已知屬，其中芽孢桿菌屬細菌最多，占77.17%，為優(yōu)勢屬，包含5個已知種，其次是賴氨酸芽孢桿菌屬，占19.43%，為優(yōu)勢屬，包含1個已知種，最少的也為鞘氨醇芽孢桿菌屬，僅占3.42%；接種Y13R的油茶病株（H4）葉片內可培養(yǎng)內生細菌主要屬于5個已知屬，以芽孢桿菌屬和賴氨酸芽孢桿菌屬居多，分別占71.20%和18.46%，為優(yōu)勢屬；以上表明菌株Y13對油茶葉片內的群落結構有明顯的影響，促進了土著細菌群體的多樣性。

圖2 不同處理油茶葉片內生細菌類群組成及相對分離頻率

2.2.3 菌株Y13對油茶葉片內可培養(yǎng)內生細菌數量分析 由表3可知，不同處理下的油茶葉片內優(yōu)勢類群的數量有較大差異。油茶健株（H1）內的優(yōu)勢類群數量波動不大；接種油茶炭疽病病原菌3 d后，枯草芽孢桿菌的數量急劇升高，為2.62×104CFU/g，是油茶健株（H1）的77.12倍，隨著炭疽病原菌的對油茶的侵染，枯草芽孢桿菌的數量逐漸降低，到接種15 d時，出現(xiàn)第2個高峰，數量為1.38×104CFU/g，之后迅速降低，到接種30 d時，僅為340 CFU/g；肺炎克雷伯菌為油茶病株（H2）接種后期所特有，數量為2.82×104CFU/g和3.62× 103CFU/g。

接種Y13R之后的油茶健株（H3）和油茶病株（H4）葉片內的優(yōu)勢類群數量都發(fā)生了變化，其中油茶健株（H3）葉片內枯草芽孢桿菌的數量變化幅度較大，是油茶健株對照（H1）的4.41-54.59倍；接種Y13R的油茶病株（H4）葉片內枯草芽孢桿菌的數量是油茶病株對照（H2）的3.37-82.82倍；以上表明菌株Y13的接入能夠顯著提高油茶葉片內的枯草芽孢桿菌數量，有利于抑制油茶炭疽病病原菌的增長。

3 討論

拮抗菌能否在植物體內有效定殖是防病的一個重要因素［8］。本研究表明標記菌株Y13R能在油茶

葉片內定殖，并且在油茶健株和病株上的定殖特性表現(xiàn)的有所不同。標記菌株Y13R在油茶健株和油茶病株葉片內的定殖時間可長達30 d以上，定殖能力強。接種6至15 d時，標記菌株Y13R在油茶病株葉片內的定殖密度逐漸比健株高，這可能是由于標記菌株Y13R與油茶炭疽病原菌競爭生態(tài)位點和營養(yǎng)物質，標記菌株Y13R更有競爭優(yōu)勢，接種20至30 d后，油茶病株上炭疽病斑開始出現(xiàn)，土著細菌群體數量迅速增長，使得拮抗細菌Y13R處于不利的競爭狀態(tài)，因此可能使得標記菌株Y13R在油茶病株葉片內的定殖密度低于健株。同樣，Bacon研究也表明，從玉米中分離出的內生枯草芽孢桿菌與玉米病原真菌串珠鐮孢有相同的生態(tài)位點，該菌能在玉米體內迅速定殖和繁殖，可有效降低該病原真菌及其毒素的積累［9］。李湘民等［10］研究了Pf7-14和B5423-R在水稻健株和感染紋枯病菌Rhizoctonia solani水稻病株上的定殖以及對土著細菌群體的影響，結果表明在水稻病斑上B5423比Pf7-14具有更強的競爭能力；同時也表明引入的拮抗細菌同土著細菌群體在營養(yǎng)和空間上競爭激烈，且土著細菌群體更具有競爭優(yōu)勢。

表3 不同處理油茶葉片內優(yōu)勢類群的數量變化（103CFU/g）

油茶健株葉片上的細菌優(yōu)勢種群為Bacillus subtilis、Lysinibacillus sphaericus和Bacillus cereus。與接種油茶炭疽病原菌的油茶病株相比，油茶病株葉片上增加了Klebsiella pneumoniae，其平均相對分離頻率為17.17%；接種后期，具有抗菌活性的菌株Bacillus subtilis，在接種Y13菌株的油茶病株（H4）葉片上的數量顯著高于油茶病株（H2）。在這期間，拮抗細菌Y13可能占據有利于營養(yǎng)和空間競爭的生態(tài)位點，并抑制油茶炭疽病原菌的增長。

本實驗室對內生拮抗細菌Y13在油茶葉片上的定殖能力及對土著細菌的影響進行了研究，為油茶高效生防菌劑的開發(fā)與應用提供理論依據。此外，關于Y13菌株定殖與油茶植株、油茶植株體內微生物群落及油茶炭疽病菌之間的多元交互作用還有待進一步研究。

4 結論

內生拮抗菌株Y13能夠在油茶健株和病株葉片內穩(wěn)定定殖，接種30 d后仍分別能檢測到6.60×103CFU/g和3.56×103CFU/g的標記菌株；油茶葉片內可培養(yǎng)內生細菌主要屬于5個屬的7個已知種，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、鞘氨醇菌屬（Sphingomonas）和假單胞菌屬（Pseudomonas），以芽孢桿菌屬和賴氨酸芽孢桿菌屬為優(yōu)勢屬。菌株

Y13對油茶健株和病株葉片內的群落結構和數量有明顯的影響，能促進土著細菌群體的多樣性，同時能夠顯著提高油茶葉片內的枯草芽孢桿菌數量，有利于抑制油茶炭疽病病原菌的增長。

［1］ 李春平, 李清華, 鐘偉. 油茶常見病害的發(fā)生與防治［J］. 安徽農業(yè)科學, 2003, （6）：162-180.

［2］ 丁國春, 付鵬, 李紅梅, 等. 枯草芽孢桿菌 AR11 菌株對南方根結線蟲的生物防治［J］. 南京農業(yè)大學學報, 2005, 28（2）：46-49.

［3］ 吳藹民, 顧本康, 付正擎, 等. 內生菌對棉花黃萎病的田間防效及增產作用［J］. 江蘇農業(yè)科學, 2000（5）：38-39.

［4］ 林玲, 張愛香, 金中時, 等. 生防細菌與黃腐酸綠源寶促進棉花生長及防治黃萎病的效果［J］. 江蘇農業(yè)學報, 2006, 22（2）：122-126.

［5］ 楊海蓮, 孫曉璐, 宋未, 等. 水稻內生陰溝腸桿菌 MR12的鑒定及其固氮和防病作用研究［J］. 植物病理學報, 2001, 31（l）：92-93.

［6］ Chen C, Banske EM, Musson G, et al. Biological control of Fusarium wilt on cotton by use of endophytic bacteria［J］. Biological Control, 1995, 5（1）：83-91.

［7］ 馬英元, 欒非時, 馬鴻艷, 等. 甜瓜白粉病內生拮抗細菌的篩選鑒定及其防治效果的研究［J］. 植物保護, 2011, 37（2）：25-30.

［8］ Paulitz TC, Belanger RR. Biological control in greenhouse systems［J］. Annual Review of Phytopathology, 2001, 39：103-133.

［9］ 布婷婷, 周國英, 劉君昂, 等. 油茶內生拮抗細菌Y13菌株16SrDNA序列分析及抑菌機理研究［J］. 經濟林研究, 2012, 30（3）：11-15.

［10］ 盧麗俐. 油茶炭疽病拮抗內生細菌的篩選、發(fā)酵及抑菌機理研究［D］. 長沙中南林業(yè)科技大學, 2009.

［11］ Kloepper JW, Schroth MN. Plant growth-promotingRhizobacteriaand plant growth under gnotobiotic conditions［J］. Phytopathology, 1981, 71（6）：642-644.

［12］ 閻孟紅, 蔡正求, 韓繼剛, 等. 植物內生細菌在防治植物病害中的應用研究［J］. 生物技術通報, 2004（3）：8-12.

［13］ 李湘民, 許志剛, Mew TW. 稻株上拮抗細菌的定殖及其對土著細菌的影響［J］. 生態(tài)學報, 2008, 28（8）：3868-3874.

［14］ 楊秀榮, 田 濤, 孫淑琴, 等. GFP 標記生防細菌 B579 及其定殖能力檢測［J］. 植物病理學報, 2013, 43（1）：82-87.

［15］ 殷幼平, 袁訓娥, 李強, 等. 生防菌枯草芽孢桿菌 CQBS03的綠色熒光蛋白基因標記及其在柑橘葉片上的定殖［J］. 中國農業(yè)科學, 2010, 43（17）：3555-3563.

［16］ 余超, 肖榮鳳, 劉波, 等. 生防菌 FJAT-346-PA 的內生定殖特性及對香蕉枯萎病的防治效果［J］. 植物保護學報, 2010, 12（6）： 493-498.

［17］ 農倩, 陳雪鳳, 黎起秦, 等. 水稻內生細菌B196的鑒定及其對水稻紋枯病的防治作用［J］. 中國生物防治學報, 2011, 27（1）：99-103.

［18］ 李斌, 謝關林, 呂意琳, 等. 水稻革蘭氏陽性細菌的主要種群結構及對紋枯病和惡苗病菌的拮抗性［J］. 中國水稻科學, 2006, 20（1）：84-88.

［19］ 周林, 程萍, 喻國輝, 等. 枯草芽孢桿菌 TR21 在香蕉體內及根際的定殖動態(tài)［J］. 中國農學通報, 2010, 26（19）：392-396.

［20］ Parke JL, Gurian-Scherman D. Diversity of theBurkholderia cepaciacomplex and implications for risk assessment of biological control strains［J］. Annual Review of Phytopathology, 2001, 39：225-258.

（責任編輯 李楠）

Colonization of Bacillus subtilis Y13 in Camellia oleifera Leaves and Its Effect on Native Bacteria

Wang Ruiqin Zhou Guoying Liu Junang Li Dongqin Meng Qingmin
（Key Laboratory of the Ministry of Education for Non-timber Product Forest Silviculture and Protection，Central South University of Forestry &Technology，Changsha 410004）

The colonization capacity of strain Y13 in the Camellia oleifera, was investigated by marking with rifampicin, periodical sampling, and recovering bacteria through diluting-plate method, as well as the effects of Y13 on native bacterial population were also studied by diluting-plate and 16S rDNA methods, which would provide a basis for ecological control of camellia anthracnose. The results showed strain Y13Rdisplayed good colonization in camellia oleifera, 30 days after inoculation, 6.60×103CFU/g and 3.56×103CFU/g strains Y13Rcould be detected in healthy and diseased leaves, respectively. Endophytic bacteria isolated from Camellia oleifera belong to 5 genera of 7 species, Bacillus, Lysinibacillus, Klebsiella, Sphingomonas and Pseudomonas, Bacillus and Lysinibacillus was the most prevalent genera. The group and amount of predominant species had evident distinction in healthy and diseased leaves. The diversities of bacteria in the Camellia oleifera leveas were improved by Y13 treatment and suppressed the pathogen propagation.

Camellia anthracnose Endophytic antagonistic bacteria Colonization Native bacteria

2013-10-15

國家自然科學基金項目（31170598）

王瑞芹，女，碩士研究生，研究方向：應用微生物；E-mail：wrqzps@163.com

劉君昂，男，教授，博士，研究方向：森林保護；E-mail：kjc9620@163.com