三角帆蚌四核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星的開(kāi)發(fā)及特征分析

韓學(xué)凱李家樂(lè)，2王照旗白志毅

（1.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2.上海高校水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué) E-研究院，上海 201306）

三角帆蚌四核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星的開(kāi)發(fā)及特征分析

韓學(xué)凱1李家樂(lè)1，2王照旗1白志毅1

（1.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2.上海高校水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué) E-研究院，上海 201306）

用磁珠富集法和生物素標(biāo)記（ATAC）5為探針構(gòu)建了三角帆蚌基因微衛(wèi)星富集文庫(kù)。利用PrimerSelect軟件對(duì)得到的微衛(wèi)星序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并合成得到43對(duì)引物，初篩后發(fā)現(xiàn)有20對(duì)引物可以擴(kuò)增出穩(wěn)定、清晰的目的產(chǎn)物帶。熒光標(biāo)記這20對(duì)引物，然后用36只洞庭湖三角帆蚌擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)17對(duì)引物呈現(xiàn)多態(tài)性。17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因數(shù)的范圍為6-28。期望雜合度（He）、觀測(cè)雜合度（Ho）的范圍分別為0.677 6-0.946 4、0.638 9-1.000 0。多態(tài)信息含量（PIC）在0.630-0.929之間。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，其中有12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)滿足Hardy-Weinberg平衡條件。與本實(shí)驗(yàn)室之前開(kāi)發(fā)的二核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星相比，該17對(duì)四核甘酸重復(fù)微衛(wèi)星具有更高多態(tài)性，且更易于采用聚丙烯酰胺凝膠電泳等傳統(tǒng)方法分析基因型，有利于節(jié)約成本，從而為三角帆蚌群體遺傳分析、親子鑒定等技術(shù)提供了準(zhǔn)確、價(jià)格低廉的微衛(wèi)星標(biāo)記。

三角帆蚌 微衛(wèi)星 四核苷酸重復(fù) 多態(tài)性

三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）是我國(guó)特有的淡水珍珠蚌，其產(chǎn)珠質(zhì)量佳，所產(chǎn)珍珠占全世界淡水珍珠的90%以上［1-3］。近些年來(lái)，養(yǎng)殖三角帆蚌中出現(xiàn)的產(chǎn)珠質(zhì)量差、個(gè)體變小等一系列問(wèn)題，對(duì)珍珠的產(chǎn)量和效益都造成較大的影響［4］。因而篩選培育抗逆性好、生長(zhǎng)性狀佳、產(chǎn)珠質(zhì)量?jī)?yōu)的品種，促進(jìn)三角帆蚌養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，是目前三角帆蚌遺傳育種研究的主要方向。

由于微衛(wèi)星的突變率高，可產(chǎn)生大量多態(tài)性豐富的位點(diǎn)，如今已作為一種良好的分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于個(gè)體識(shí)別、種質(zhì)資源鑒定、生物遺傳作圖、遺傳多樣性分析等方面的研究［5，6］。關(guān)于貝類微衛(wèi)星開(kāi)發(fā)與應(yīng)用研究，國(guó)外已見(jiàn)較多報(bào)道［7-10］，國(guó)內(nèi)對(duì)淡水貝類如三角帆蚌［11-14］、背瘤麗蚌（Lamprotula leai）［15］、褶紋冠蚌（Cristaria plicata）［16］和背角無(wú)齒蚌（Anodonta woodiana）［17］的微衛(wèi)星研究也逐漸開(kāi)展起來(lái)。但目前國(guó)內(nèi)淡水貝類開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記主要是雙核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星，用傳統(tǒng)銀染法檢測(cè) PCR 產(chǎn)物時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物常常會(huì)出現(xiàn)影子帶，對(duì)于PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度的正確分析干擾較大。研究人類基因組發(fā)現(xiàn)，四堿基重復(fù)微衛(wèi)星序列具有豐富的多態(tài)性，易于 PCR 擴(kuò)增，具有明顯的等位基因差異，極少出現(xiàn)影子帶［18］，故分型效果較二核苷酸微衛(wèi)星要好。魯翠云等［19］研究鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）后發(fā)現(xiàn)，在黑龍江鯉野生群體中，四核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星標(biāo)記表現(xiàn)出的多態(tài)性水平高于雙核苷酸重復(fù)。同樣，譚照君等［20］在研究鰱魚(yú)（Hypophthalmichtysmolitrix）中不同核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星特征時(shí)，發(fā)現(xiàn)四核甘酸重復(fù)微衛(wèi)星不但多態(tài)性更高，而且遺傳穩(wěn)定性更好，更加適合作為種群分析的工具標(biāo)記。在我國(guó)特有淡水貝類三角帆蚌中，四核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星是否同樣具有高度多態(tài)性及其特征如何，還未見(jiàn)到有關(guān)研究報(bào)道。本研究通過(guò)生物素標(biāo)記的微衛(wèi)星探針獲得并篩選一些三角帆蚌四核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星位點(diǎn)，通過(guò)對(duì)其多態(tài)性初步分析，以期為三角帆蚌群體遺傳分析、親子鑒定技術(shù)、種質(zhì)資源的保護(hù)等研究提供更多高質(zhì)量的微衛(wèi)星分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用在洞庭湖采集到的三角帆蚌野生群體作為試驗(yàn)樣本。

1.2 方法

1.2.1 三角帆蚌基因組DNA的提取及富集文庫(kù)的構(gòu)建 取三角帆蚌外套膜組織作為提取材料，用苯酚-氯仿提取法提取其基因組DNA。基因組DNA的酶切和富集文庫(kù)的構(gòu)建主要參照羅明等［14］和Li等［21］的方法。用RsaⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行三角帆蚌基因組DNA的酶切，用試劑盒回收200-1 000 bp大小的片段用于文庫(kù)構(gòu)建。微衛(wèi)星序列的富集采用生物素標(biāo)記的（ATAC）5探針，具體操作步驟與羅明等［14］所述相同。1.2.2 微衛(wèi)星引物設(shè)計(jì) 先用Sequencher軟件去除載體及接頭后，再使用SSRhunter軟件來(lái)查找其中微衛(wèi)星位點(diǎn)，之后用GeneQuest軟件查找并去除冗余序列。最后用PrimerSelect軟件在微衛(wèi)星序列上進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

1.2.3 多態(tài)性微衛(wèi)星引物的初篩及熒光標(biāo)記引物分析 引物設(shè)計(jì)好后，首先送上海邁浦生物科技有限公司合成普通引物，然后用3個(gè)三角帆蚌的基因組DNA作為模板來(lái)初篩這些引物。經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析擴(kuò)增產(chǎn)物，從中挑選能夠穩(wěn)定擴(kuò)增出條帶且與設(shè)計(jì)引物片段大小相符的引物，經(jīng)初步篩選的引物用來(lái)合成5'上游熒光引物（FAM、HEX）。從洞庭湖中采集36只野生三角帆蚌，取每只蚌的外套膜組織進(jìn)行基因組DNA提取。用熒光引物對(duì)36個(gè)模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的熒光PCR產(chǎn)物送上海邁浦生物科技有限公司進(jìn)行STR測(cè)序分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 用GeneMapper v4.0軟件對(duì)公司送來(lái)的基因組掃描結(jié)果進(jìn)行分析并估算等位基因大小，利用PopGen32軟件計(jì)算以下參數(shù)：等位基因數(shù)（N）、有效等位基因數(shù)（A）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He），并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)（HWE）。用Cervus軟件來(lái)分析多態(tài)信息含量（PIC）。

2 結(jié)果

2.1 多態(tài)性引物的設(shè)計(jì)與篩選結(jié)果

用Sequencher軟件去除接頭及載體序列后，利用PrimerSelect設(shè)計(jì)并合成引物43對(duì)。用3個(gè)三角帆蚌的基因組DNA為模板對(duì)這43對(duì)引物進(jìn)行初步篩選，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到20對(duì)穩(wěn)定擴(kuò)增、條帶清晰并且大小相符的引物。對(duì)這20對(duì)引物的5'上游熒光引物分別用 FAM和 HEX 兩種熒光基團(tuán)來(lái)修飾，用36只洞庭湖野生三角帆蚌個(gè)體對(duì)合成的20對(duì)熒光引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用GeneMapper v4.0軟件對(duì)公司送來(lái)的基因組掃描結(jié)果進(jìn)行分析后顯示，合成的20對(duì)引物中17對(duì)均具有良好的多態(tài)性（引物信息見(jiàn)表1），并對(duì)這17

對(duì)引物多態(tài)性進(jìn)行深入評(píng)價(jià)。

表 1 三角帆蚌 17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的核心序列及其引物特征

2.2 微衛(wèi)星多態(tài)性引物對(duì)群體遺傳評(píng)估分析

用PopGen32軟件對(duì)這17對(duì)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行多態(tài)性評(píng)價(jià)分析，結(jié)果（圖1）顯示擴(kuò)增產(chǎn)物大小在163-438 bp之間，17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因數(shù)變動(dòng)范圍為6-28，平均每對(duì)引物獲得等位基因數(shù)為17.52，其中位點(diǎn)Hcuca301獲得等位基因數(shù)最少，僅為 6個(gè)，位點(diǎn)Hcuga726獲得等位基因數(shù)最多，為28個(gè)，有效等位基因數(shù)在3.014 0-14.982 7之間，平均值為9.365 8，Ho在0.638 9-1.000，平均值為0.833 3；而He在0.677 6-0.946 4之間，平均值為0.877 9。用Cervus軟件來(lái)分析多態(tài)信息含量，多態(tài)信息含量 PIC在0.630-0.929之間，平均值為0.853 1。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)顯示，17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中有12個(gè)滿足Hardy-Weinberg平衡條件（P>0.05）。17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

3 討論

雖然近些年微衛(wèi)星標(biāo)記在水產(chǎn)動(dòng)物中得到大

量開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，但是目前多數(shù)水產(chǎn)動(dòng)物開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記多為雙核苷酸重復(fù)。在有關(guān)人類二核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星研究中，發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物常常會(huì)出現(xiàn)比主帶小2 bp的影子帶［22，23］。本實(shí)驗(yàn)室利用二核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星開(kāi)展三角帆蚌種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及其育種工作中也發(fā)現(xiàn)同樣問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)，多核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記可以減少擴(kuò)增產(chǎn)物中“影子帶”的出現(xiàn)，比二核苷酸重復(fù)序列遺傳穩(wěn)定性更高且擴(kuò)增更忠實(shí)［24］，故基因分型效果較二核苷酸微衛(wèi)星要好，且更易于采用聚丙烯酰胺等傳統(tǒng)方法分析基因型。目前國(guó)內(nèi)四核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記在水產(chǎn)動(dòng)物中開(kāi)發(fā)應(yīng)用較少，僅見(jiàn)鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）［19］、鰱魚(yú)（Hypophthalmichtysmolitrix）［20］、方正銀鯽（Carassius auratus gibelioBloch）［25］、草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellu）［26］中有相關(guān)研究，而淡水貝類中關(guān)于四核苷酸的開(kāi)發(fā)與研究卻鮮有報(bào)道。而隨著磁珠富集法的發(fā)展和完善，四核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星篩選比例得到提高，并逐漸被開(kāi)發(fā)應(yīng)用。本研究通過(guò)構(gòu)建三角帆蚌ATAC四核苷酸重復(fù)的富集文庫(kù)，從中篩選和開(kāi)發(fā)出17對(duì)四核甘酸重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記用于研究。

表 2 三角帆蚌17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳參數(shù)

圖1 引物Hcuca0340在部分個(gè)體的擴(kuò)增結(jié)果

多態(tài)信息含量（PIC）可以較好地反映片段的多態(tài)性和遺傳信息含量。在一個(gè)群體中，多態(tài)信息含量高低與其提供的遺傳信息多少成正比［27］。參照Botstein等［28］提出的衡量多態(tài)信息含量大小的指標(biāo)，本研究中的17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PIC在0.630-0.929之間，平均值為0.828 2，PIC值均大于0.5，為高度多態(tài)性位點(diǎn)，表明篩選微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性信息含量豐富。本實(shí)驗(yàn)室羅明等［14］曾用20對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)洞庭湖野生三角帆蚌進(jìn)行了遺傳評(píng)估，本研究與其所用的洞庭湖樣本為同一群體，并采用相同的分析方法，不同的是本研究使用的是四核甘酸重復(fù)微衛(wèi)星，因此可以通過(guò)對(duì)兩者結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，反映出雙核苷酸重復(fù)與四核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記在多態(tài)性和遺傳多樣性評(píng)價(jià)方面差別（表3）。比較發(fā)現(xiàn)，本研究的四核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星多態(tài)信息含量（PIC=0.853 1）高于羅明用雙核苷酸重復(fù)在同一群體中得到結(jié)果（PIC=0.823 9）。同樣，與許巧晴等［13］用13個(gè)雙核苷酸重復(fù)標(biāo)記對(duì)洞庭湖野生三角帆蚌的

研究結(jié)果（PIC=0.519 8）相比，本研究四核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星評(píng)價(jià)的群體多態(tài)性也明顯高。有效等位基因數(shù)反映了群體中等位基因的分布均勻度，而雜合度可以反映群體中遺傳多樣性高低。本研究17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在洞庭湖三角帆蚌野生群體擴(kuò)增到的有效等位基因數(shù)（A=9.365 8）和期望雜合度（He=0.877 9）兩項(xiàng)群體遺傳多樣性評(píng)估指標(biāo)均高于羅明等用雙核苷酸重復(fù)在同一群體得到的結(jié)果（A=6.582 2，He=0.823 9），表明四核甘酸重復(fù)評(píng)價(jià)的群體遺傳多樣性更高，遺傳變異更大。與羅明和許巧晴研究結(jié)果相比，雖然本研究所用樣本量稍多，但總體可以判斷在三角帆蚌中四核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星多態(tài)性水平高于二核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星。此結(jié)果與譚照君等［20］通過(guò)研究鰱魚(yú)和魯翠云等［19］研究鯉魚(yú)后得出結(jié)論相似。四核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星多態(tài)性更高可能是真核生物中四核苷酸重復(fù)多存在于非編碼區(qū)，在生物進(jìn)化過(guò)程中承受的選擇壓力較小，因而可以較為“自由”突變的緣故［29］。

對(duì)17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中有5個(gè)位點(diǎn)偏離了平衡，這可能是雜合子缺失或研究采用樣本較少等緣故，這種情況在研究二核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星時(shí)也經(jīng)常出現(xiàn)，屬合理現(xiàn)象。選取本研究中開(kāi)發(fā)的幾對(duì)四核甘酸重復(fù)微衛(wèi)星進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)傳統(tǒng)銀染法來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增帶譜清晰，“影子帶”出現(xiàn)較少。這與Edwards等［18］研究人類中四核甘酸重復(fù)微衛(wèi)星特征所得結(jié)果相一致。因此本研究開(kāi)發(fā)的四核甘酸微衛(wèi)星可作為理想的分子標(biāo)記。

表3 不同類型核心序列的微衛(wèi)星對(duì)洞庭湖三角帆蚌的評(píng)估效果比較

4 結(jié)論

本研究開(kāi)發(fā)的17對(duì)四核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星標(biāo)記，不但具有高度的多態(tài)性，而且是較二核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星更為高效的分子標(biāo)記，可以在不采用SSR熒光標(biāo)記分析技術(shù)，節(jié)約成本情況下，用傳統(tǒng)非熒光電泳檢測(cè)方法同樣取得較好效果，能夠?yàn)槿欠鋈后w遺傳分析、親子鑒定技術(shù)等研究提供廉價(jià)、準(zhǔn)確的分子標(biāo)記，是很好的微衛(wèi)星資源。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Development and Characteristics of Tetranucleotide Repeat Microsatellite Loci in Hyriopsis cumingii

Han Xuekai1Li Jiale1，2Wang Zhaoqi1Bai Zhiyi1
（1. Key Laboratory of Freshwater Fishery Germplasm Resources， Ministry of Agriculture， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306；2. Aquaculture Division，E-Institute of Shanghai Universities，Shanghai 201306）

A microsatellite-enriched library of the Hyriopsis cumingii was constructed using repeat-enrichment method with biotinlabeled oligo（ATAC）5and streptavidin coated magnetic beads. Forty-three pairs of primers designed by software PrimerSelect according to the sequences were synthesized for the pre-screening. Twenty pairs of primers which could amplify constant and legible expected DNA products were labeled by fluorescence. Seventeen microsatellite loci showed high levels in genetic polymorphism testing on 36 individuals sampled from Dongting Lake. The number of alleles at each locus ranged from 6 to 28. The expected and observed heterozygosities varied from 0.677 6 to 0.946 4 and from 0.638 9 to 1.000, respectively. The PIC value ranged from 0.630 to 0.929. Twelve microsatellite loci fitted to Hardy-Weinberg equilibrium. Compared with the previous dinucleotide repeat microsatellite developed in our laboratory, these 17 tetranucleotide repeat microsatellite loci showed higher polymorphism. Also, these 17 microsatellite loci can make genotyping easier by conventional methods such as polyacrylamide gel electrophoresis and save cost. Therefore, it offered accurate and inexpensive microsatellite markers for population genetic analysis and paternity test in Hyriopsis cumingii.

Hyriopsis cumingii Microsatellite Tetranucleotide repeat Polymophism

2013-12-16

上海市高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái)項(xiàng)目（ZF1206），國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD26B04），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272657），上海市青年科技啟明星（A類）（12QA1401400），上海工程技術(shù)中心能力提升項(xiàng)目（13DZ2280500）

韓學(xué)凱，男，碩士，研究方向：種質(zhì)資源與遺傳育種；E-mail：15618062362@163.com

白志毅，男，博士，副教授，研究方向：種質(zhì)資源與遺傳育種；E-mail：zybai@shou.edu.cn