草魚細(xì)胞系CIK酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建及初步應(yīng)用

閆秀英謝吉國李杰丁燏吳灶和魯義善簡紀(jì)常

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨廣東省高等學(xué)校水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088；2. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州 510225）

草魚細(xì)胞系CIK酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建及初步應(yīng)用

閆秀英1謝吉國1李杰1丁燏1吳灶和2魯義善1簡紀(jì)常1

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨廣東省高等學(xué)校水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088；2. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州 510225）

旨在探索草魚呼腸孤病毒與宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)間的相互作用，運(yùn)用SMART技術(shù)構(gòu)建了草魚腎組織細(xì)胞系CIK（Ctenopharyngodon idellus kidney）的酵母雙雜交cDNA文庫。提取CIK細(xì)胞總RNA后，分離純化mRNA，然后以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，再在DNA聚合酶作用下，通過長距離PCR，擴(kuò)增雙鏈cDNA。利用SMART技術(shù)，通過同源重組的方法，在酵母株Y187中構(gòu)建了草魚CIK細(xì)胞全長cDNA文庫。經(jīng)檢測(cè)，未擴(kuò)增文庫的轉(zhuǎn)化率為1.6×105，文庫容量為2.4×106，插入的雙鏈cDNA片段的長度為250-2 000 bp，文庫滴度為7×107CFU/mL，重組率為98%，此文庫具有良好的cDNA片段多態(tài)性和完整性。利用構(gòu)建的CIK酵母雙雜交文庫，以草魚呼腸孤病毒的VP7和VP5蛋白作為誘餌進(jìn)行篩選試驗(yàn)，得到VP7相互作用蛋白的陽性菌落，未得到VP5相互作用蛋白的陽性菌落。草魚CIK細(xì)胞酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建為研究草魚呼腸孤病毒與宿主細(xì)胞間的互作機(jī)制提供了重要研究工具。

草魚腎組織細(xì)胞系 酵母雙雜交 cDNA文庫 蛋白質(zhì)互作

草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）是草魚出血病的病原，給草魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展造成了嚴(yán)重的損失［1］。目前，研究人員已對(duì)呼腸孤病毒的形態(tài)［2-4］、流行病學(xué)［4］、檢測(cè)［5，6］、生物學(xué)特性［7］等方面進(jìn)行了研究，但GCRV的感染機(jī)制和致病機(jī)制知之甚少，GCRV蛋白的功能有待進(jìn)一步研究［8-10］。草魚腎組織細(xì)胞系CIK（Ctenopharyngodon idelluskidney）來源于草魚的腎臟組織［11］，是GCRV及多種病毒的收納細(xì)胞系［12］，廣泛應(yīng)用于呼腸孤病毒分子生物學(xué)的各種試驗(yàn)研究［13-16］。

借由感染的機(jī)制，病毒利用宿主的細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行自我復(fù)制，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用在病毒整個(gè)生命周期中發(fā)揮著極其重要的作用，研究病毒與宿主蛋白的相互作用對(duì)于揭示病毒致病機(jī)理、病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)引起的信號(hào)傳導(dǎo)、新型藥物的開發(fā)與篩選有重要意義。自酵母雙雜交技術(shù)［17］建立以來，通過不斷改進(jìn)和優(yōu)化，極大地推動(dòng)了蛋白質(zhì)相互作用的研究，酵母雙雜交技術(shù)已應(yīng)用于病毒蛋白分析鑒定、細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)、藥物靶位點(diǎn)篩選等領(lǐng)域的研究［18-22］。近年來，酵母雙雜交技術(shù)作為研究蛋白質(zhì)間相互作用的有力工具，已在水產(chǎn)動(dòng)物及其病毒相關(guān)研究中得以應(yīng)用［10，23-27］。Cai等［10］在對(duì)GCRV非結(jié)構(gòu)蛋白NS80與其NS38、VP4、VP6蛋白相互作用研究中發(fā)現(xiàn)，NS80在病毒組裝、加工、形成中發(fā)揮著重要的作用。GCRV VP5蛋白可能介導(dǎo)病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞，VP7可能通過改變蛋白構(gòu)象協(xié)助VP5蛋白穿透宿主細(xì)胞膜進(jìn)入宿主細(xì)胞［6］，探尋VP5和VP7的相互作用蛋白。深入了解病毒與宿主間的相互作用機(jī)制，對(duì)于草魚病毒性出血病的防治和在分子水平上揭示病毒的致病機(jī)理具有重要意義。本研究構(gòu)建CIK酵母Y187雙雜交cDNA文庫，旨在為研究草魚呼腸孤病毒與宿主細(xì)胞間的相互作用，識(shí)別和鑒定相關(guān)的宿主細(xì)胞因子奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 CIK細(xì)胞 草魚腎組織細(xì)胞系CIK（Ctenopharyngodon idelluskidney，CIK）購買于深圳檢驗(yàn)檢疫局，培育于添加10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基中，28℃溫育。

1.1.2 菌株與載體 酵母文庫菌株Y187和載體pGADT7-Rec均購自Clontech公司。含重組質(zhì)粒pGBKT7-VP7的Y2H Gold誘餌菌株和含重組質(zhì)粒pGBKT7-VP5的Y2H Gold誘餌菌株由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建和保存［28］。

1.2 方法

1.2.1 草魚細(xì)胞系CIK總RNA的提取與mRNA的純化 在25 mL培養(yǎng)瓶中接種生長狀態(tài)良好的CIK細(xì)胞，待CIK呈單層細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底，移去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液漂洗單層細(xì)胞2次，移去緩沖液后向培養(yǎng)瓶中加入1 mL Trizol進(jìn)行裂解，然后按RNA抽提試劑盒（上海生工）說明書進(jìn)行RNA提取，提取的總RNA用RNase-free H2O溶解并檢測(cè)質(zhì)量。

按照mRNA純化試劑盒（Oligotex mRNA Kit，QIAGEN）操作方法從提取的總RNA中純化mRNA。

1.2.2 cDNA文庫的構(gòu)建

1.2.2.1 cDNA第一鏈、第二鏈的合成和雙鏈cDNA的純化 利用SMART技術(shù)合成全長cDNA，根據(jù)酵母雙雜交文庫構(gòu)建試劑盒（Make Your Own “Mate & Plate” Library System，Clontech）操作說明合成cDNA第一鏈和第二鏈，PCR反應(yīng)條件為：95℃ 30 s；95℃ 10 s，68℃ 6 min，25個(gè)循環(huán)；68℃ 5 min。

按照CHROMA SPIN TE-400 Columns說明書純化雙鏈cDNA。純化產(chǎn)物用25 μL去離子水溶解并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2.2 dscDNA、pGADT7-Rec和carrier DNA共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187 Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化按照酵母轉(zhuǎn)化試劑盒（YeastmakerTMYeast Transformation System 2，Clontech）操作說明進(jìn)行。利用dscDNA和pGADT7-Rec同源重組共轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.3 文庫克隆子的收獲 按酵母轉(zhuǎn)化試劑盒（YeastmakerTMYeast Transformation System 2，Clontech）說明操作，將轉(zhuǎn)化子涂布于150 mm SD/-Leu平板的克隆子菌落長到2-3 mm即可收獲克隆子。

1.2.4 文庫鑒定 文庫收獲前隨機(jī)挑取克隆子菌落PCR檢測(cè)cDNA插入片段捕獲質(zhì)粒的情況。菌落PCR檢測(cè)按照全長cDNA合成PCR預(yù)混液（MatchmakerTMInsert Check PCR Mix 2，Clontech）操作說明

進(jìn)行。

1.2.5 互作蛋白的篩選 誘餌菌株在30℃培養(yǎng)3-5 d，分別挑取直徑大于2 mm的單菌落接種于50 mL SD/-Trp/Kan液體培養(yǎng)基中，30℃、250-270 r/min 孵育至OD600=0.8，室溫1 000×g離心 5 min，棄上清，用 4 mL SD/-Trp/Kan液體培養(yǎng)基重懸沉淀，細(xì)胞濃度大于 1.0×108/mL。取1 mL CIK 文庫菌液，取出10 μL在SD/-Trp/Kan平板上測(cè)定文庫滴度（>2.0× 107CFU/mL）后，與上述4 mL誘餌菌液在2 L無菌燒瓶中融合，加 45 mL 含50 μg/mL Kan 的 2×YPDA肉湯，于 30℃慢速震蕩（30-50 r/min）培養(yǎng)20-24 h。待觀察到“三葉草”接合子形成，1 000×g離心10 min，用10 mL 0.5×YPDA/Kan溶解沉淀，確定總體積。以每平板 200 μL涂QDO/X-α-Gal/AbA平板，30℃培養(yǎng)3-5 d。挑取生長在QDO/X-α-Gal/AbA平板上的藍(lán)色克隆，轉(zhuǎn)移到高篩選率的QDO/X-α-Gal/AbA平板上反復(fù)篩選，以確定陽性克隆。

陽性克隆經(jīng)酵母菌落PCR擴(kuò)增、鑒定后，送上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序后的陽性克隆cDNA序列進(jìn)行Blast分析。

2 結(jié)果

2.1 草魚CIK細(xì)胞總RNA提取及mRNA純化

提取的草魚CIK細(xì)胞總RNA有3條清晰的條帶（圖1），分別是28S、18S和5S rRNA。所提取總RNA樣品A260/A280=2.004，濃度為2.51 μg/μL，表明所提取的草魚CIK細(xì)胞總RNA質(zhì)量良好，無DNA、蛋白質(zhì)污染及小分子污染，28S比18S條帶亮。

圖1 草魚CIK細(xì)胞總RNA瓊脂糖凝膠電泳

利用Oligotex mRNA Kit純化的草魚CIK細(xì)胞mRNA其大小多集中在250-2 000 bp之間且分布均勻（圖2）。

圖2 純化mRNA瓊脂糖凝膠電泳

2.2 cDNA第一鏈合成和雙鏈cDNA純化結(jié)果

以接頭引物SMART III-modified oligo反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA一鏈產(chǎn)物在100-250 bp之間有一相對(duì)集中的條帶，但大多數(shù)片段主要集中在250-2 000 bp之間，在該區(qū)域處有較清晰的豐富帶的產(chǎn)生（圖3）。

圖3 合成的cDNA第一鏈電泳圖

利用CHROMA SPIN TE-400 Columns純化dsc-DNA，其片段大小在200 bp以上。純化后的dscDNA大多集中在250-2 500 bp之間，彌散成明顯的瀑布狀（圖4）。

圖4 dscDNA純化電泳圖

2.3 文庫的構(gòu)建及鑒定

100倍稀釋度時(shí)，平板克隆子個(gè)數(shù)為480個(gè)，計(jì)算得出轉(zhuǎn)化率為1.6×105，文庫容量為2.4×106。

文庫收獲后，經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，其滴度為7×107CFU/mL，滿足試劑盒建庫要求。

酵母菌落PCR檢測(cè)結(jié)果顯示文庫質(zhì)粒插入片段的大小均在250 bp以上，大多分布在500-2 000 bp（其中1 000-2 000 bp的片段占46%）之間（圖5），挑取總克隆的50%，2 000 bp以上只出現(xiàn)一個(gè)條帶，可能與挑取菌落的隨機(jī)性有關(guān)，cDNA文庫的重組率為98%。

圖5 酵母菌落PCR電泳圖

2.4 GCRV VP7和VP5相互作用蛋白的篩選

構(gòu)建的pGBKT7-VP7和pGBKT7-VP5誘餌載體轉(zhuǎn)入酵母Y2H Gold后，經(jīng)檢測(cè)無自激活性和對(duì)酵母的毒性現(xiàn)象。誘餌菌株與文庫菌液混合后可觀察到“三葉草”接合子形成，在QDO/X-α-Gal/AbA培養(yǎng)基上生長，再用高篩選率的QDO/X-α-Gal/AbA平板反復(fù)篩選時(shí)，獲得VP7互作蛋白的陽性菌落（圖6箭頭所示），并沒有篩選到VP5互作蛋白的陽性菌落。

將VP7陽性菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，獲得陽性菌落的cDNA序列（圖7）。對(duì)陽性克隆序列進(jìn)行Blastn比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，在數(shù)據(jù)庫中具有較大片段的同源序列，與斑點(diǎn)叉尾鮰40S核糖體蛋白S20具有89%的同源性，同源性最高；與其他多數(shù)生物核糖體蛋白S20的同源性均在83%以上。

圖6 QDO/ X-α-Gal/AbA培養(yǎng)基上與VP7相互作用蛋白篩選的陽性菌落

圖7 陽性菌落序列

3 討論

全長cDNA文庫不僅包含完整的開放閱讀框，還需含有5'和3'非編碼區(qū)序列。RNA的純度和完整性決定著cDNA文庫的構(gòu)建質(zhì)量即序列信息的完整性和多態(tài)性［29］。真核生物總RNA的完整性通常用28S、18S rRNA的質(zhì)量來衡量，28S與18S的強(qiáng)度一般為1.5-2.5∶1。本研究以草魚腎組織細(xì)胞系CIK為試驗(yàn)材料提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳顯示28S rRNA比18S rRNA的亮度稍高，并且條帶清晰，提取的總RNA質(zhì)量較好，可以進(jìn)一步用于mRNA的純化。

一般認(rèn)為非哺乳動(dòng)物的mRNA大多分布在0.5-3.0 kb之間，為防止出現(xiàn)利用總RNA構(gòu)建文庫產(chǎn)生的小片段冗余現(xiàn)象，本研究進(jìn)行了mRNA的純化。純化的草魚CIK細(xì)胞mRNA的條帶大小集中在250-2 000 bp之間且分布均勻，250-500 bp之間的片段條帶也相對(duì)較亮和較集中，可能是由于mRNA純化過程中mRNA發(fā)生降解和斷裂產(chǎn)生的。有些研究人員認(rèn)為mRNA不需要純化，純化mRNA反而更容易造成降解［30］。本研究純化的mRNA符合構(gòu)建文庫的一般規(guī)律和本試驗(yàn)要求，可以用于全長cDNA文庫的構(gòu)建。

構(gòu)建高質(zhì)量的全長cDNA文庫是非常關(guān)鍵的，文庫中如何區(qū)分完整的cDNA和變短的cDNA片段尚無較好的方法。由于小片段的cDNA擴(kuò)增時(shí)間

短，即使小片段數(shù)量很少，在足夠的循環(huán)次數(shù)下仍能大大超過全長cDNA數(shù)量，產(chǎn)生大量冗余。本研究利用Clontech公司Make Your Own “Mate&PlateTM”Library試劑盒合成全長cDNA。該試劑盒采用SMART（Switching mechanism at 5' end of RNA transcript）技術(shù)即模板轉(zhuǎn)換技術(shù)合成全長cDNA，且試劑盒所帶cDNA雙鏈引物的5'端都攜帶有和文庫質(zhì)粒pGADT7-Rec相同的同源重組片段，cDNA全長合成后不需經(jīng)過雙酶切就可通過同源重組和文庫質(zhì)粒相連接。序列信息不完整的mRNA逆轉(zhuǎn)錄時(shí)由于5'端序列信息的缺失，MMLV便不會(huì)在cDNA第一鏈3'末端添加Oligo（C），因此不完全的cDNA第一鏈便不會(huì)繼續(xù)合成第二鏈cDNA，最終獲得的cDNA都是全長cDNA。同時(shí)采用YeastmakerTM酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)2，酵母轉(zhuǎn)化效率高，且易于篩選轉(zhuǎn)化子。本研究成功構(gòu)建了草魚細(xì)胞系CIK酵母雙雜交cDNA文庫，且cDNA較完整，為研究草魚呼腸孤病毒與宿主細(xì)胞間的互作機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

構(gòu)建cDNA文庫是研究蛋白互作的重要途徑，鑒于細(xì)胞系CIK在GCRV研究方面的廣泛應(yīng)用［13-16］，采用SMART技術(shù)成功構(gòu)建了CIK的酵母Y187 AD融合cDNA文庫。cDNA文庫質(zhì)量評(píng)價(jià)主要是檢測(cè)文庫的代表性和序列完整性，本研究所構(gòu)建文庫的原始庫容量為2.4×106CFU，滴度為7×107CFU/mL，重組率為98%，達(dá)到了CLONTECH公司SMART文庫構(gòu)建指標(biāo)（原始文庫的庫容大于1×106CFU，滴度大于1×107CFU/mL，重組率大于85%），此文庫具有較好的cDNA片段多態(tài)性和完整性，可用于進(jìn)一步的文庫篩選。將GCRV VP7和VP5作為誘餌蛋白進(jìn)行雜交試驗(yàn)，篩選到VP7的相互作用蛋白，但未篩選到VP5的相互作用蛋白（利用生物信息學(xué)技術(shù)分析預(yù)測(cè)VP5無跨膜結(jié)構(gòu)域，確切的原因有待試驗(yàn)驗(yàn)證）。

VP7相互作用蛋白的陽性克隆序列Blast比對(duì)結(jié)果可以斷定得到的陽性克隆序列結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確，此序列經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析顯示無完整的閱讀框，可能是由于mRNA在反轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生降解，故認(rèn)為此陽性克隆序列為草魚腎組織細(xì)胞系40S核糖體亞基S20蛋白基因的一段序列。與陽性克隆序列同源的核糖體蛋白S20除了作為組成40S核糖體亞基的組分外，還可以結(jié)合到自身mRNA特定位點(diǎn)抑制其自身基因翻譯表達(dá)［31］。根據(jù)VP7與陽性克隆序列間的相互作用推測(cè)，VP7可能通過與草魚核糖體蛋白S20的結(jié)合抑制了S20調(diào)節(jié)自身翻譯表達(dá)的功能，從而使S20出現(xiàn)高表達(dá)量異常。由于未獲得完整的陽性克隆序列開放閱讀框，對(duì)于陽性克隆和VP7是如何發(fā)生作用的以及發(fā)生作用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域無法作出預(yù)測(cè)。由于陽性克隆序列編碼蛋白屬于胞內(nèi)蛋白，因此該結(jié)果尚不能驗(yàn)證目前推測(cè)的GCRV VP7蛋白的功能。病毒蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)如何利用宿主的翻譯系統(tǒng)；在病毒粒子的組裝、釋放過程中，病毒和宿主間究竟發(fā)生了怎樣的相互作用，其具體機(jī)制究竟是怎樣的都不清楚，尚需要進(jìn)一步的研究。對(duì)GCRV VP7和VP5的互作蛋白和作用機(jī)制進(jìn)行研究，將有助于揭示GCRV的感染機(jī)理。CIK酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建對(duì)于GCRV與宿主細(xì)胞間的互作機(jī)制研究、揭示病毒致病機(jī)理及其在宿主細(xì)胞內(nèi)引起的信號(hào)傳導(dǎo)和新型藥物的開發(fā)和篩選具有重要的意義。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了草魚細(xì)胞系CIK雙雜交cDNA文庫，并應(yīng)用此文庫篩選到GCRV VP7互作蛋白的陽性克隆，推測(cè)VP7的互作蛋白可能是草魚腎組織細(xì)胞系40S核糖體亞基S20蛋白。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Construction and Preliminary Application of the Yeast Two-hybrid cDNA Library from Grass Carp CIK Cells

Yan Xiuying1Xie Jiguo1Li Jie1Ding Yu1Wu Zaohe2Lu Yishan1Jian Jichang1
（1. Guangdong Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，F(xiàn)isheries College of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088；2. Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225）

In order to explore the interactions between grass carp reovirus and the host cell proteins, the yeast two-hybrid cDNA library from grass carp CIK（Ctenopharyngodon idellus kidney） was constructed by SMART technology. Total RNA of the CIK cells was extracted and mRNA was purified. Then, mRNA as the template, the first strand of cDNA was synthesized by reverse transcription. The double-stranded cDNA was amplified through the long-distance PCR with the DNA polymerase. The cDNA library from grass carp CIK cells was constructed in the yeast strain 187, using SMART technology and the homologous recombination method. After testing, the conversion rate and the capacity of the original library was 1.6×105and 2.4×106, respectively. The length of the inserted double-stranded cDNA fragments were 250-2 000 bp. The titer of the library was 7×107CFU/mL and the recombination rate was 98%. This library had the well polymorphism and the integrity of the cDNA fragments. Using the constructed yeast two-hybrid from the CIK cells, the VP7 and VP5 protein in grass carp reovirus were as the baits for the screening experiment. The positive colonies of the interacting proteins of VP7 had been acquired, without the positive colony of the interacting protein of VP5. The construction of the yeast two-hybrid cDNA library from the grass carp CIK cells provided an important research tool for the study on the interaction mechanism of grass carp reovirus with the host cell.

Ctenopharyngodon idellus kidney（CIK） Yeast two-hybrid cDNA library Protein interaction

2013-11-26

國家“973”計(jì)劃項(xiàng)目（2009CB118704）

閆秀英，女，博士，講師，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物病害防控；E-mail：yanxiuying1201@126.com

簡紀(jì)常，男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物免疫學(xué)及病害控制；E-mail：jianjc@gmail.com