質(zhì)譜非標(biāo)記定量分析小麥抗條銹病近等基因系蛋白質(zhì)變化

黃宇馮晶饒力群徐世昌潘映紅

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081；3.國(guó)家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程，北京 100081；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

質(zhì)譜非標(biāo)記定量分析小麥抗條銹病近等基因系蛋白質(zhì)變化

黃宇1，2，3馮晶4饒力群1徐世昌4潘映紅2，3

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081；3.國(guó)家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程，北京 100081；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

利用基于液相色譜串聯(lián)Orbitrap質(zhì)譜（Q Exactive）的非標(biāo)定量（Label-free）技術(shù)，對(duì)小麥抗病單基因近等基因系Taichung29*6/Yr10和背景品種Taichung29葉片的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行了比較分析。經(jīng)MASCOT軟件搜庫(kù)，在兩個(gè)樣品中共同鑒定到2 257個(gè)蛋白，其中有準(zhǔn)確定量信息的蛋白共1 549個(gè)，含量變化大于2倍的差異蛋白有102個(gè)。對(duì)102個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了Gene Ontology（GO）功能注釋和分析，發(fā)現(xiàn)他們多數(shù)定位于細(xì)胞基質(zhì)和核糖體等細(xì)胞器，具備結(jié)合、催化等功能，主要參與代謝、細(xì)胞過(guò)程、應(yīng)激等生物學(xué)進(jìn)程，其中超氧化物歧化酶、甲硫氨酰氨肽酶、溶酶體-β-葡萄糖苷酶和鐵蛋白等可能與小麥抗病單基因近等基因系Taichung 29*6/Yr10的抗病性有一定相關(guān)性。

小麥 條銹病 抗病性 蛋白質(zhì)組學(xué) 非標(biāo)記定量 Q Exactive質(zhì)譜

小麥條銹病是由小麥條銹病菌（Puccinia striiformisf. sp.tritici）引起的小麥葉部病害，嚴(yán)重時(shí)也危害穗部。小麥條銹病在許多國(guó)家和地區(qū)均有發(fā)生，我國(guó)是小麥條銹病發(fā)生最廣泛的國(guó)家之一［1，2］。防治小麥條銹病最有效、最經(jīng)濟(jì)、最安全的方法是利用抗病品種。雖然國(guó)際上已經(jīng)命名了49個(gè)位點(diǎn)的55個(gè)小麥抗條銹病基因（Yr1-Yr52），但其中大多數(shù)抗病基因具有生理?；裕３Ｒ?yàn)闂l銹菌小種的快速變異而失去抗性，目前，只有少數(shù)的抗病基因仍保持抗性，如Yr5、Yr10和Yr15等［2-5］。隨著大

量物種基因組測(cè)序的完成，人們清楚的意識(shí)到單純從基因組和轉(zhuǎn)錄組的信息并不能完全揭示生命活動(dòng)的規(guī)律，作為功能基因組學(xué)研究?jī)?nèi)容之一的蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和前沿［6］。目前，已知的小麥抗條銹病基因都是通過(guò)遺傳推導(dǎo)確定的，僅有極少數(shù)基因如Yr36的序列已經(jīng)明確。因此，從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度去揭示病原物致病機(jī)理和抗病品種的抗病機(jī)制，對(duì)小麥抗條銹性的合理利用和小麥條銹病的可持續(xù)控制極具研究?jī)r(jià)值。

雙向電泳是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的傳統(tǒng)方法［7-9］，但該技術(shù)本身存在分離蛋白范圍有限、歧視效應(yīng)、與質(zhì)譜聯(lián)用效果差等諸多缺陷［10］。近年來(lái)，隨著高精度生物質(zhì)譜技術(shù)和基于生物信息學(xué)的海量數(shù)據(jù)處理技術(shù)的進(jìn)步，規(guī)?；木_測(cè)量細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組的表達(dá)變化已成現(xiàn)實(shí)。定量蛋白質(zhì)組研究方法也從傳統(tǒng)的基于二維凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定的策略向著更高準(zhǔn)確度、更大范圍和更高通量的方向發(fā)展。蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法根據(jù)是否對(duì)蛋白質(zhì)/多肽進(jìn)行標(biāo)記可以分為標(biāo)記和非標(biāo)記兩類。標(biāo)記定量方法是基于在肽段中引入穩(wěn)定同位素標(biāo)記（如2H、13C、15N、18O），使得在同一次質(zhì)譜掃描中標(biāo)記“輕”和“重”同位素的多肽具有相同的色譜行為和離子化效率，此時(shí)成對(duì)出現(xiàn)的質(zhì)譜峰信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度可以精確地反映樣品中蛋白質(zhì)的比例。根據(jù)同位素?fù)饺氲姆绞剑瑯?biāo)記方法可以分為代謝標(biāo)記、酶促標(biāo)記和化學(xué)標(biāo)記等，在這些標(biāo)記方法中，化學(xué)標(biāo)記的種類最為繁多，應(yīng)用也最為廣泛。代表性的化學(xué)標(biāo)記方法包括標(biāo)記多肽（蛋白質(zhì)）N端氨基的iTRAQ［11］、標(biāo)記C端羧基的酯化標(biāo)記、針對(duì)半胱氨酸巰基的ICAT［12］以及與質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRMMS）技術(shù)聯(lián)用的mTRAQ標(biāo)記技術(shù)［13］等。以上這些標(biāo)記定量方法具有良好的定量可靠性，不僅可以用于不同樣品間的相對(duì)定量分析，還可以用于蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量分析，但成本普遍偏高。相對(duì)于傳統(tǒng)的標(biāo)記定量法，非標(biāo)定量法（Label-free）不需要在樣本分析前對(duì)蛋白/多肽進(jìn)行標(biāo)記，避免了樣品處理過(guò)程中可能造成的損失，在檢測(cè)肽段的數(shù)量、蛋白質(zhì)的覆蓋率和分析通量方面具有較大優(yōu)勢(shì)，且不受樣品來(lái)源和數(shù)量限制。非標(biāo)定量法通過(guò)比較質(zhì)譜譜圖計(jì)數(shù)（spectrum counting）或質(zhì)譜峰強(qiáng)度（peak area intensity）分析不同來(lái)源樣品蛋白的含量變化，是目前比較蛋白質(zhì)組學(xué)上運(yùn)用較為普遍的一種手段。Boeri等［14］采用Label-free方法和MALDI-Q-TOF 技術(shù)在定量分析表皮生長(zhǎng)因子的磷酸化蛋白動(dòng)力學(xué)、蛋白質(zhì)覆蓋率、序列鑒定、識(shí)別磷酸化位點(diǎn)等方面取得了新進(jìn)展。Wang等［15］采用非標(biāo)定量方法分別結(jié)合LCQ、LTQ-FT質(zhì)譜對(duì)多種樣品的重現(xiàn)性作了測(cè)試，并詳細(xì)研究分析了蛋白質(zhì)的磷酸化過(guò)程。最近，Zhang等［16］借助LTQ質(zhì)譜和PTMap軟件，鑒定出酵母菌組蛋白上新的丙酰化和丁?；揎?，并發(fā)現(xiàn)了14種潛在的、未知的蛋白修飾。

本研究以非標(biāo)定量法結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)小麥感病品種Taichung29（T29）以及抗病近等基因系Taichung 29*6/Yr10（TYr10）進(jìn)行差異蛋白分析，并通過(guò)生物信息學(xué)的方法分析差異蛋白所屬的細(xì)胞成分（Cellular component）、分子功能（Molecular function）和生物學(xué)途徑（Biological process），旨在為小麥條銹病的可持續(xù)控制研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來(lái)源 小麥感病品種T29以及抗病品種近等基因系TYr10小麥均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所條銹病組繁殖培養(yǎng)。

1.1.2 材料的培養(yǎng) 小麥種子經(jīng)浸潤(rùn)，催芽后種于口徑50 cm×100 cm塑料盆中，置于自控溫室中（溫度晝15-20℃/夜11-14℃，光照強(qiáng)度6 000 Lx，光照時(shí)間12 h），直到幼苗于溫室內(nèi)培養(yǎng)至1葉期。

1.1.3 主要儀器和試劑 HPLC液相系統(tǒng)Easy-nLC 1000（美國(guó)Thermo Scientific公司）；Q Exactive MS質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Scientific公司）；Mini垂直蛋白電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；冷凍高速離心機(jī)（美國(guó)科峻儀器公司）；Lambda25型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó) Perkin-Elmer 公司）；溴酚藍(lán)bromophenol blue、碘乙酰胺IAA、二硫基蘇糖醇DTT、聚丙烯酰胺Acr、過(guò)硫酸鈉APS、甘氨酸Glycine、四甲基乙二胺TEMED、十二烷基硫酸鈉SDS、三羥甲基氨基甲烷Tris（美國(guó)GE Healthcare公司）；測(cè)序級(jí)胰蛋白酶TPCK-Trypsin（美國(guó)Promega公司）；乙腈ACN、三

氟乙酸TFA（美國(guó)Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 小麥葉片總蛋白的提取 根據(jù)劉偉霞等［17］的方法稍加修改，稱取新鮮1葉期小麥葉片2 g，液氮研磨20 min，轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，加入50 mL預(yù)冷丙酮（2% DTT，10% TCA）-20℃過(guò)夜沉淀（至少12 h）。離心40 000×g，1 h，棄去上清。加入50 mL冰丙酮（2% DTT）放入-20℃，靜置1 h（中間震蕩3次）40 000×g，1 h離心，重復(fù)3次，將沉淀至于通風(fēng)廚吹干。沉淀即為蛋白粗樣品，若要長(zhǎng)期儲(chǔ)存則放于-80℃冰箱保存，或?qū)⒏煞廴苡赨A緩沖液中（尿素8 mol/L，Tris-HCl 100 mmol/L，pH8.5）用于電泳以及酶解。

1.2.2 蛋白定量 參照Bradford法進(jìn)行蛋白定量［18］，采用BSA做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 SDS-PAGE 1D SDS-PAGE參考儀器說(shuō)明并在Mini-protean Ⅲ cell垂直板電泳儀上進(jìn)行。

1.2.4 FASP酶解 取蛋白總量為1 mg的蛋白裂解樣品于10 k超濾管中，并加入DTT（20 mmol/L）還原3 h，加入200 μL UA緩沖液，離心14 000×g，15 min離心，重復(fù)兩次。加入100 μL IAA，600 r/min混勻1 min，暗處孵育20 min，14 000×g，10 min離心。加入200 μL UA，再離心15 min，重復(fù)兩次。加入200 μL ABC（碳酸氫銨0.05 mol/L），離心14 000×g，10 min離心，重復(fù)兩次。轉(zhuǎn)入新的收集管，加入一定量ABC，加入Trypsin（1∶50）；混勻，37℃搖床16-20 h離心14 000×g，10 min離心，加入40 μL 50 mmol/L ABC，離心14 000×g 10 min離心，凍干，-20℃保存。

1.2.5 色譜條件 高效液相色譜儀：Thermo Scientific Easy-nLC 1000；色譜柱：Easy-spray column（C18，2 μm，100?，75 μm×15 cm）；流動(dòng)相：A：0.1% Formic acid，2% Acetonitrile in water；B：0.1% Formic acid in Acetonitrile；梯度：3%-8% B in 10 min，8%-20% B in 78 min，20%-30% B in 15 min，30%-90% B in 10 min，90% B for 7 minutes；流速：250 nL/min。

1.2.6 質(zhì)譜分析條件 質(zhì)譜儀：Thermo Scientific Q Exactive；噴霧電壓：2.3 kV；毛細(xì)管溫度：250℃；S-lens：55%；碰撞能量：27% HCD；分辨率設(shè)置：一級(jí)70 000@m/z 200，二級(jí)17 500@m/z 200；母離子掃描范圍：m/z 300-1800；子離子掃描范圍：start from m/z 100；Data-dependent MS/MS：Top 15。

1.2.7 Q Exactive質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析 原始文件（raw file）使用Maxquant軟件進(jìn)行Label-free定性和定量分析，搜索相應(yīng)的小麥蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。具體搜庫(kù)參數(shù)如下：前體離子質(zhì)量偏差：10 ppm；碎片離子質(zhì)量偏差：25 mmu；固定修飾：半胱氨酸（Cysteine）烷基化（+57.021 Da）；動(dòng)態(tài)修飾：甲硫氨酸（Methionine）氧化（+15.995 Da）；天冬酰胺和谷氨酰胺（Asparagine & Glutamine）脫氨基化（+0.984 Da）；酶：trypsin；漏切位點(diǎn)：2。數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)自UNIPROT（http：//www. uniprot.org/）。

1.2.8 差異表達(dá)蛋白的GO（Gene Ontology）分析根據(jù)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中的各蛋白GO注釋，并結(jié)合其來(lái)源，人工選擇鑒定所得到的蛋白最可能的細(xì)胞成分、分子功能和生物學(xué)途徑，并對(duì)其進(jìn)行基因富集度計(jì)算和圖示化。鑒定蛋白的GO信息來(lái)自UNIPROT網(wǎng)站（http：//www.uniprot.org/）。

2 結(jié)果

2.1 小麥葉片總蛋白的提取分析與SDS-PAGE電泳

小麥葉片通過(guò)TCA/丙酮沉淀，用UA裂解液溶解，通過(guò)Bradford法進(jìn)行定量，測(cè)出TYr10中蛋白濃度為7.80 mg/mL，T29提取蛋白濃度為8.01 mg/mL，計(jì)算得出總蛋白的提取率分別為0.58%和0.60%。通過(guò)SDS-PAGE（圖1）對(duì)提取結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，兩組樣品之間平行度較好，相應(yīng)的蛋白條帶清晰，初步表明蛋白提取效果理想，樣品純度適于進(jìn)行下一步工作。

圖1 小麥葉片總蛋白SDS-PAGE電泳圖

2.2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定

將蛋白粗樣品復(fù)溶、酶切之后，經(jīng)過(guò)Easy-nLC 1000液相系統(tǒng)進(jìn)行色譜分離，并通過(guò)Q Exactive進(jìn)行質(zhì)譜分析（3次技術(shù)重復(fù)），得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行Mascot搜索，共鑒定到2 257個(gè)蛋白。對(duì)已鑒定蛋白通過(guò)嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選（peptide FDR & protein FDR≤1%），且設(shè)定每個(gè)蛋白需有兩條以上肽段提供定量比值，最終確定具有可靠定量信息的蛋白有1 549個(gè)（數(shù)據(jù)略）。

2.3 差異表達(dá)蛋白篩選結(jié)果及其GO分析

在上述具有定量信息的1 549個(gè)蛋白中，共篩選出蛋白表達(dá)水平差異大于2倍，且3次技術(shù)重復(fù)RSD<50%的蛋白102個(gè)，其中低表達(dá)31個(gè)，高表達(dá)71個(gè)（表1）。這些蛋白的相對(duì)分子量（MW）分

布為4.42 kD（D2K937）-164.95 kD（M7ZSA1），等電點(diǎn)（pI）分布為4.71（M7Z596）-12.01（Q95H53），相對(duì)分子量和理論等電點(diǎn)分布廣泛。

表1 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析差異蛋白結(jié)果（TYr10 vs T29）

續(xù)表

按照UNIPROT（http://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中的各蛋白質(zhì)的GO注釋分別進(jìn)行細(xì)胞成分、分子功能和生物學(xué)途徑分類。結(jié)果（圖2）顯示，102個(gè)差異蛋白中有63個(gè)沒(méi)有明確的亞細(xì)胞定位，其余主要來(lái)源于細(xì)胞基質(zhì)（36.3%）與核糖體（23.6%）等細(xì)胞器；分子功能涉及結(jié)合（41.2%）、催化（37.3%）等方面；生物學(xué)途徑GO分析表明，這些蛋白主要參與代謝（58.8%）、細(xì)胞過(guò)程（50.0%）、應(yīng)激（3.9%）等生物學(xué)進(jìn)程。這些蛋白中，具有細(xì)胞成分（Cellular component）GO注釋信息的蛋白39個(gè)，占總差異蛋白的38.2%，其中細(xì)胞基質(zhì)蛋白37個(gè)，基質(zhì)蛋白中也分布于核糖體、細(xì)胞核和膜系統(tǒng)的蛋白分別為24、8和3個(gè)，另有2個(gè)膜蛋白不分布于細(xì)胞基質(zhì)；具有分子功能（Molecular function）GO注釋信息的蛋白85個(gè)，占到總差異蛋白的84.3%，其中具有結(jié)合功能的蛋白42個(gè)，在這42個(gè)蛋白中也具有催化活性、結(jié)構(gòu)大分子功能的蛋白分別為21個(gè)和5個(gè)，具有催化活性的蛋白一共是38個(gè)，其中1個(gè)同時(shí)具有大分子結(jié)構(gòu)功能，另有7個(gè)具有其他分子功能的蛋白；具有生物學(xué)途徑（Biological process）GO注釋信息的蛋白75個(gè)，占總差異蛋白的73.6%，其中代謝途徑相關(guān)蛋白60個(gè)，在這60個(gè)蛋白中同時(shí)與細(xì)胞進(jìn)程、應(yīng)激反應(yīng)、轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程以及生物調(diào)節(jié)過(guò)程相關(guān)的蛋白分別有41、2、1和5個(gè)。與細(xì)胞進(jìn)程相關(guān)的蛋白一共有51個(gè)，其中同時(shí)與轉(zhuǎn)運(yùn)以及生物調(diào)節(jié)過(guò)程相關(guān)的蛋白分別為3個(gè)和6個(gè)。應(yīng)激反應(yīng)、轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程和生物調(diào)節(jié)過(guò)程相關(guān)的蛋白總數(shù)分別為4、 6和7個(gè)。

圖2 T29與TYr10葉片間差異蛋白的GO注釋圖

3 討論

樣品制備是質(zhì)譜非標(biāo)記定量分析的關(guān)鍵步驟之一，其成功與否對(duì)研究結(jié)果影響巨大，但目前還沒(méi)有一種提取植物葉片完整蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)方法［19］。由于小麥等植物葉片中含有RuBisCo等一些高拷貝數(shù)的持家蛋白，可能導(dǎo)致某些調(diào)控因子和信號(hào)因子等低豐度蛋白難以檢測(cè)，對(duì)樣品進(jìn)行去除高豐度蛋白處理可以在一定程度上緩解此類問(wèn)題，然而此類方法成本昂貴或操作步驟復(fù)雜，容易造成蛋白的丟失［20，21］。本研究運(yùn)用TCA/丙酮沉淀法對(duì)小麥葉片總蛋白進(jìn)行提取，蛋白提取率分別為0.58%和0.60%，達(dá)到目前的一般標(biāo)準(zhǔn)［9，22］，在此基礎(chǔ)上首次運(yùn)用質(zhì)譜非標(biāo)定量法對(duì)TYr10與T29進(jìn)行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究。結(jié)果顯示，在兩個(gè)樣品中共鑒定到2 257個(gè)蛋白，其中具有準(zhǔn)確定量信息的蛋白1 549個(gè)，從已定量的蛋白中共篩選到102個(gè)差異表達(dá)蛋白。

由于在不同真核生物中的大多數(shù)基因擁有相似的生物學(xué)功能，因此在某些物種獲得基因或蛋白質(zhì)的生物學(xué)信息可輔助揭示其他物種中相應(yīng)基因或蛋白質(zhì)的功能，綜合這些信息的GO注釋目前已成為功能基因生物信息學(xué)分析的核心內(nèi)容之一［23，24］。本研究從GO數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了102個(gè)差異表達(dá)蛋白所屬的細(xì)胞成分、生物學(xué)途徑和分子功能的GO注釋，并人工對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO功能分析和圖示化。這一結(jié)果表明該鑒定蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)具有較好的生物學(xué)功能覆蓋范圍，包括光合作用、糖代謝以及能量代謝等一系列生物過(guò)程，這與報(bào)導(dǎo)過(guò)的植物抗病相關(guān)

研究結(jié)果相一致［25-27］。

在已鑒定的差異蛋白中，代謝相關(guān)蛋白60個(gè)，其中Q96185為超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）。SOD廣泛存在于真核細(xì)胞與原核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、線粒體和葉綠體中，可清除生物體內(nèi)超氧陰離子自由基，有效地抵御氧自由基對(duì)有機(jī)體的傷害［28］，研究還發(fā)現(xiàn)大豆在感染SMV后引起了活性氧的累積，誘導(dǎo)防御酶活性的增強(qiáng)，從而使SOD活性的上升［29］，而SOD在TYr10中表達(dá)有明顯上升可能與其抗病性有關(guān)。M7Z0K9為甲硫氨酰氨肽酶（Methionine aminopeptidase，MetAP）。MetAP在細(xì)胞內(nèi)的主要功能是切除細(xì)胞內(nèi)新合成蛋白的N端甲硫氨酸，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白互作、腫瘤生長(zhǎng)以及細(xì)菌和病毒感染等生理病理過(guò)程發(fā)揮著重要的作用［30，31］，但是與TYr10的抗病性的關(guān)系尚不清楚。M7ZME5為溶酶體-β-葡萄糖苷酶（Lysosomal beta glucosidase）。馬成等［8］曾報(bào)道Taichung29*6/Yr5葉片在接種條銹菌CYR32后β-葡萄糖苷酶水平下降，本研究發(fā)現(xiàn)溶酶體-β-葡萄糖苷酶在未接種的TYr10中表達(dá)較T29低，提示該蛋白可能與抗病性有一定相關(guān)性。本研究還鑒定到6個(gè)與運(yùn)轉(zhuǎn)相關(guān)的差異蛋白，其中Q5G1L6為鐵蛋白（Ferritin）。鐵蛋白廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)，在植物中作為專門的貯鐵蛋白，是植物光合作用和固氮等生化反應(yīng)的鐵源，不僅調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵的含量，而且是一種重要的脅迫反應(yīng)蛋白，在植物的發(fā)育、抵抗氧化損害等方面發(fā)揮重要的作用［32］，該蛋白在TYr10中的高表達(dá)可能與其抗病性有關(guān)。此外，還鑒定到4個(gè)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的差異蛋白，其中M7Z2R9（Putative disease resistance protein RXW24L）與Q6PWL8（Putative vacuolar defense protein）在TYr10表達(dá)明顯提高，可能與該近等基因系的抗病機(jī)制相關(guān)，值得進(jìn)一步研究。多年來(lái)，育種工作者一直以選育和推廣抗病品種作為病害的主要防治手段，且頗見(jiàn)成效，但小麥抗條銹性喪失和抗條銹病機(jī)理一直是未能解決的問(wèn)題。對(duì)近等基因系Taichung 29*6/Yr10差異表達(dá)蛋白的分析，為理解小麥抗條銹性喪失和研究Yr10基因的抗條銹病機(jī)理提供了新的線索和思路。

4 結(jié)論

利用質(zhì)譜非標(biāo)定量技術(shù)可有效地進(jìn)行小麥蛋白質(zhì)組定量分析，運(yùn)用該技術(shù)從小麥抗病單基因近等基因系Taichung 29*6/Yr10和背景品種Taichung 29葉片中共鑒定到102個(gè)差異表達(dá)蛋白。已鑒定到的差異表達(dá)蛋白大多定位于細(xì)胞基質(zhì)以及核糖體等細(xì)胞器，具備結(jié)合、催化等功能，主要參與代謝、細(xì)胞過(guò)程、應(yīng)激等生物學(xué)進(jìn)程，其中超氧化物歧化酶、甲硫氨酰氨肽酶、溶酶體-β-葡萄糖苷酶和鐵蛋白等可能與小麥抗病單基因近等基因系Taichung 29*6/Yr10的抗病性有一定相關(guān)性。

致謝：質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)處理得到賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司色譜與質(zhì)譜部聶愛(ài)英博士的幫助。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Label-free Quantitative Proteomics Analysis of a Wheat Near-isogenic Line Pair with Q Exactive Mass Spectrometer

Huang Yu1，2，3Feng Jing4Rao Liqun1Xu Shichang4Pan Yinghong2，3
（1. College of Bbioscience and Biotechnology，Hunan Agriculture University，Changsha 410128；2. Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081；3. The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement，Beijing 100081；4. Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）

In this study, the protein expression of a wheat near-isogenic line pair, Taichung 29*6/Yr10 and Taichung 29, have been compared with label-free quantitative proteomic approach based on liquid chromatography tandem Q Exactive hybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer. By MASCOT database search, a total of 2 257 proteins were identified from both of the samples, and among of them 1 549 proteins were accurately quantitated and 102 differentially expressed proteins（>2 fold）were detected. Gene ontology（GO）analysis showed that these differential proteins were mainly localized to cell matrix and organelles such as ribosome, and mainly involved in binding and catalytic functions. Among of 102 proteins which mainly take part in metabolic, cellular and stress responses processes, Superoxide dismutase, Methionine aminopeptidase, Lysosomal-β-glucosidase, and Ferritin may play some important roles in Taichung 29*6/Yr10 resistance to Yellow rust.

Wheat Yellow rust Resistance Proteomics Label-free quantitation Q Exactive Mass Spectrometer

2013-12-16

國(guó)家“863”高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2008AA10Z115），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30971874），轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)（2009ZX08012-011B）

黃宇，男，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：nictkk@163.com

潘映紅，男，研究員，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：panyinghong@caas.cn