數(shù)字?jǐn)z像頭和生物顯微鏡對(duì)顯微圖像定量分析的影響

陳錦龍 李精秀 藍(lán)永洪

1.海南醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，海南海口571199；2.海南醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?71199

數(shù)字?jǐn)z像頭和生物顯微鏡對(duì)顯微圖像定量分析的影響

陳錦龍1李精秀2藍(lán)永洪2

1.海南醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，海南?？?71199；2.海南醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?71199

目的探討數(shù)字?jǐn)z像頭和生物顯微鏡對(duì)顯微圖像定量分析的影響情況。方法以物鏡測(cè)微尺為研究標(biāo)定，將不同數(shù)字?jǐn)z像頭安裝同一生物顯微鏡（不同攝像頭組）和同一數(shù)字?jǐn)z像頭安裝不同生物顯微鏡（不同顯微鏡組）后對(duì)測(cè)微尺進(jìn)行攝像，應(yīng)用圖像分析軟件分別測(cè)試不同測(cè)微尺圖像每微米所代表的像素值，并對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行分析比較。結(jié)果CX31顯微鏡下DPIXEL200、DP520DC、MD20、YM310和DP26所攝取的測(cè)微尺圖像每微米所代表的像素值分別為（2.398±0.011）、（5.217±0.019）、（4.770±0.012）、（4.764±0.020）和（4.437±0.023），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而CX31、CX41、B204TR和BK-FL4顯微鏡下DPIXEL200攝取的測(cè)微尺圖像每微米所代表的像素值分別為（2.398±0.011）、（2.400±0.009）、（2.409±0.013）和（2.395±0.012），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論數(shù)字?jǐn)z像頭對(duì)顯微圖像定量分析影響明顯，而生物顯微鏡則影響不明顯。

顯微圖像定量分析；數(shù)字?jǐn)z像頭；生物顯微鏡

顯微圖像定量分析是指用量化的方法以數(shù)字表達(dá)形式對(duì)顯微圖像中各種結(jié)構(gòu)信息的定量描述及在此基礎(chǔ)上對(duì)顯微圖像所作的定量分析、推理、判斷和概括[1-2]。顯微圖像定量分析主要立足在顯微圖像上，顯微圖像的攝取方式直接關(guān)系到顯微圖像定量分析的結(jié)果，而顯微圖像的攝取必須依賴連接計(jì)算機(jī)的數(shù)碼顯微鏡，組織切片或細(xì)胞涂片經(jīng)生物顯微鏡放大后，由數(shù)字?jǐn)z像頭中的CCD圖像傳感器采集下來(lái)，通過(guò)圖像采集卡轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)輸入計(jì)算機(jī)，這就是所要定量分析的顯微圖像[3-4]。因此同一顯微鏡上的不同攝像頭，或者不同顯微鏡上的同一攝像頭所采集的顯微圖像有可能存在差異，而這種差異是否影響顯微圖像定量分析結(jié)果。同時(shí)顯微圖像的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可通過(guò)結(jié)構(gòu)參數(shù)值的大小體現(xiàn)出來(lái)，顯微圖像定量分析的結(jié)構(gòu)參數(shù)包括幾何學(xué)參數(shù)（平面結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)參數(shù)），光度學(xué)參數(shù)（灰度、吸光度和色度學(xué)參數(shù)等）以及在幾何學(xué)參數(shù)或光密度參數(shù)基礎(chǔ)上測(cè)算出的特化參數(shù)（陽(yáng)性單位、DNA指數(shù)和細(xì)胞增生指數(shù)等）[5-6]，其中光度學(xué)參數(shù)容易受到成像和染色條件等其它因素的影響，而幾何學(xué)參數(shù)基本不受影響[7-8]。本研究以物鏡測(cè)微尺為研究標(biāo)定，分別在不同數(shù)字?jǐn)z像頭和生物顯微鏡的成像條件下進(jìn)行攝像，獲取物鏡測(cè)微尺的顯微圖像，采用圖像分析軟件測(cè)試每微米所代表的像素值，并對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行分析比較，探討數(shù)字?jǐn)z像頭和生物顯微鏡對(duì)顯微圖像定量分析的影響，為定量分析提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及軟件

數(shù)字?jǐn)z像頭（DPIXEL200和DP520DC，廣州市泰柯計(jì)算機(jī)有限公司；MD20，廣州市明美光電技術(shù)有限公司；YM310，山東易創(chuàng)電子有限公司；DP26，日本Olympus公司）；生物顯微鏡（CX31和CX41，日本Olympus公司；B204TR和BK-FL4，重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司）；顯微鏡攝像接口（U-TV0.5XC-3，U-TV 0.63XC，日本Olympus公司；TV1XC，廣州市明美光電技術(shù)有限公司）；物鏡測(cè)微尺（日本Olympus公司）；圖像分析軟件（Image-Pro Plus 6.0，美國(guó)Media Cybernetics公司）。

1.2 研究方法

以物鏡測(cè)微尺為研究標(biāo)定，分別在不同數(shù)字?jǐn)z像頭和不同生物顯微鏡下攝取測(cè)微尺圖像。①不同數(shù)字?jǐn)z像頭組：將數(shù)字?jǐn)z像頭（DPIXEL200、DP520DC、 MD20、YM310和DP26）通過(guò)顯微鏡攝像接口安裝在生物顯微鏡（CX31）上，逐一安裝驅(qū)動(dòng)軟件，攝取測(cè)微尺的圖像；②不同生物顯微鏡組：將數(shù)字?jǐn)z像頭（DPIXEL200）通過(guò)顯微鏡攝像接口安裝在生物顯微鏡（CX31、CX41、B204TR和BK-FL4）上，攝取測(cè)微尺的圖像。上述圖像均取4個(gè)高倍鏡（40×10）視野，保存于計(jì)算機(jī)內(nèi)，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分別測(cè)試不同顯微圖像中每微米所代表的像素值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較方法（SNK法）比較不同組間的測(cè)試結(jié)果，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同數(shù)字?jǐn)z像頭對(duì)顯微圖像定量分析的影響

CX31顯微鏡下DPIXEL200、DP520DC、MD20、YM310和DP26攝取的測(cè)微尺圖像（圖1）；測(cè)試結(jié)果顯示，DPIXEL200、DP520DC、MD20、YM310和DP26所攝取的測(cè)微尺圖像每微米所代表的像素值分別為（2.398±0.011）、（5.217±0.019）、（4.770±0.012）、（4.764± 0.020）和（4.437±0.023）（圖2）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，不同數(shù)字?jǐn)z像頭攝取的測(cè)微尺圖像每微米所代表的像素值比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=15729.14，P=0.001）。

圖1 不同數(shù)字?jǐn)z像頭攝取的測(cè)微尺圖像

圖2 不同數(shù)字?jǐn)z像頭組每微米所代表的像素值

2.2 不同生物顯微鏡對(duì)顯微圖像定量分析的影響

CX31、CX41、B204TR和BK-FL4生物顯微鏡下DPIXEL200攝取的測(cè)微尺圖像（圖3）；測(cè)試結(jié)果顯示，CX31、CX41、B204TR和BK-FL4生物顯微鏡下DPIXEL200攝取的測(cè)微尺圖像每微米所代表的像素值分別為（2.398±0.011）、（2.400±0.009）、（2.409±0.013）和（2.395±0.012）（圖4）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，不同生物顯微鏡下DPIXEL200攝取的測(cè)微尺圖像每微米所代表的像素值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.033，P＞0.05）。

3 討論

形態(tài)測(cè)試主要體現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行量化分析，以及根據(jù)細(xì)胞或組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，建立定量描述組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)的概念、參數(shù)和測(cè)試方法[9-10]。顯微圖像定量分析首先要有研究目標(biāo)，如細(xì)胞涂片、組織切片等標(biāo)本，然后需要攝取顯微圖像的儀器設(shè)備，包含數(shù)字?jǐn)z像頭、生物顯微鏡和計(jì)算機(jī)，最后就是圖像分析軟件[11-12]，此過(guò)程有很多因素可以影響測(cè)試結(jié)果，如細(xì)胞涂片、組織切片的染色濃度和時(shí)間、不同規(guī)格的數(shù)字?jǐn)z像頭和生物顯微鏡以及攝像軟件的成像條件等[13]，在日常的定量學(xué)研究過(guò)程中，經(jīng)常被強(qiáng)調(diào)要在同一個(gè)數(shù)字?jǐn)z像頭及生物顯微鏡下攝取細(xì)胞圖像，才能保證所攝取的顯微圖像具有可比性，但是有些研究需要不同地域的研究機(jī)構(gòu)聯(lián)合開展，這時(shí)數(shù)字?jǐn)z像頭和生物顯微鏡就不能確保都是同一品牌和型號(hào)，這樣攝取的顯微圖像會(huì)不會(huì)影響研究結(jié)果，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差。為了探討數(shù)字?jǐn)z像頭和生物顯微鏡對(duì)顯微圖像定量分析的影響，本研究以物鏡測(cè)微尺為研究標(biāo)定，將不同數(shù)字?jǐn)z像頭安裝同一生物顯微鏡和同一數(shù)字?jǐn)z像頭安裝不同生物顯微鏡后對(duì)測(cè)微尺進(jìn)行攝像，應(yīng)用圖像分析軟件分別測(cè)試不同測(cè)微尺圖像每微米所代表的像素值，并對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，同一生物顯微鏡下不同數(shù)字?jǐn)z像頭所攝取的測(cè)微尺圖像中每微米所代表的像素值差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而不同生物顯微鏡下DPIXEL200所攝取的測(cè)微尺圖像中每微米所代表的像素值差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），即不同數(shù)字?jǐn)z像頭所攝取的顯微圖像每像素所代表的長(zhǎng)度是不一致的，而同一數(shù)字?jǐn)z像頭在不同生物顯微鏡下攝取的顯微圖像每像素所代表的長(zhǎng)度是一致的，說(shuō)明不同數(shù)字?jǐn)z像頭對(duì)顯微圖像定量分析有明顯影響，而不同生物顯微鏡則沒(méi)有影響，因?yàn)閿?shù)字?jǐn)z像頭是顯微成像的主要工具，關(guān)系到圖像的質(zhì)量高低，而生物顯微鏡只是將顯微圖像映射到數(shù)字?jǐn)z像頭，并不參與顯微圖像的成像，因此不會(huì)影響圖像的質(zhì)量。因此在顯微圖像定量分析時(shí)，如采用不同數(shù)字?jǐn)z像頭進(jìn)行顯微圖像的采集，就需要分別攝取不同數(shù)字?jǐn)z像頭物鏡測(cè)微尺的顯微圖像，然后在圖像分析軟件中進(jìn)行標(biāo)定，最后才能進(jìn)行定量測(cè)試，否則容易造成測(cè)試結(jié)果不準(zhǔn)確，而同一數(shù)字?jǐn)z像頭在任何生物顯微鏡下所攝取的顯微圖像，只需標(biāo)定一次即可進(jìn)行定量測(cè)試。因此研究人員在攝取顯微圖像進(jìn)行顯微圖像定量分析時(shí)，要考慮數(shù)字?jǐn)z像頭的差異所產(chǎn)生的影響，而對(duì)于不同生物顯微鏡帶來(lái)的差異則可忽略。

圖3 不同生物顯微鏡下DPIXEL200攝取的測(cè)微尺圖像

圖4 不同生物顯微鏡組DPIXEL200每微米所代表的像素值

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Effect of digital video camera and biom icroscope on quantitative analysis ofm icroscopic image

CHEN Jinlong1LIJingxiu2LAN Yonghong2
1.Department of Pathogenic biology,Hainan Medical University,Hainan Province,Haikou 571199,China;2.Morphological Laboratory,Hainan Medical University,Hainan Province,Haikou 571199,China

Objective To explore the effect of digital video camera and biomicroscope on quantitative analysis ofmicroscopic image.M ethods The images of objectivemicrometer in different digital video camera(different camera group) and the same digital camera to install different biologicalmicroscope(different biomicroscope group).The representative pixels of permicrometerwere tested by image analysis software,and the test results of two groups were compared and analyzed.Results The pixels representing per micrometer of DPIXEL200,DP520DC,MD20,YM310,DP26 on CX31 microscope were(2.398±0.011),(5.217±0.019),(4.770±0.012),(4.764±0.020),(4.437±0.023)respectively,the differences were high statistically significant(P＜0.01).The pixels representing per micrometer of DPIXEL200 on CX31, CX41,B204TR,BK-FL4 microscope were(2.398±0.011),(2.400±0.009),(2.409±0.013),(2.395±0.012)respectively, and there was no statistically significant difference(P＞0.05).Conclusion Digital video camera has significant influence on quantitative analysis ofmicroscopic image,and biomicroscope has not obvious effect.

Quantitative analysis ofmicroscopic image;Digital video camera;Biomicroscope

Q334

C

1673-7210（2014）01（b）-0160-03

2013-11-22本文編輯：任念）

陳錦龍（1981-），男，碩士研究生，主要從事病原生物學(xué)研究工作。

藍(lán)永洪（1978-），男，碩士研究生，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師；研究方向：定量病理學(xué)。