大慶地區(qū)馬齒莧總黃酮含量測(cè)定方法探討

韓成花 白玉華 于春月 高賽男 楊璐銘

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)（大慶），黑龍江大慶163319

大慶地區(qū)馬齒莧總黃酮含量測(cè)定方法探討

韓成花 白玉華 于春月 高賽男 楊璐銘

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)（大慶），黑龍江大慶163319

目的為大慶地區(qū)馬齒莧的內(nèi)在質(zhì)量分析提供依據(jù)。方法馬齒莧先用石油醚除去親脂性雜質(zhì)，再用甲醇超聲提取得到總黃酮；以槲皮素為對(duì)照，采用AlCl3顯色法測(cè)定總黃酮含量。結(jié)果槲皮素在0.0624～0.9984μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程Y=1.4224X-0.0234（r=0.9991）。結(jié)論該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于大慶地區(qū)馬齒莧的總黃酮含量測(cè)定。

馬齒莧；總黃酮；紫外分光光度法；AlCl3顯色法

中藥馬齒莧為馬齒莧科植物馬齒莧Portulaca oleracea L.的干燥地上部分，具有清熱解毒、涼血止血、止痢等功效，主要用于治療熱毒血痢、癰腫疔瘡、濕疹、丹毒、蛇蟲咬傷、便血、痔血、崩漏下血等[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，馬齒莧具有抗腫瘤、緩解糖尿病的癥狀及抗菌消炎、抗氧化、降血脂等藥理作用[2-5]。馬齒莧首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是我國(guó)原衛(wèi)生部劃定的78種藥食同源的野生植物之一，既可入藥，又可食用，為《中國(guó)藥典》2010年版所收載。馬齒莧生活力極強(qiáng)，耐寒、耐澇、耐蔭、耐瘠薄，對(duì)土壤要求不嚴(yán)、且河北省農(nóng)科院在鹽堿地試種的新品種特選1號(hào)馬齒莧，表現(xiàn)出產(chǎn)量高，尤其耐鹽性強(qiáng)、抗病性好等特征[6]，而大慶地區(qū)歷史上是低洼湖區(qū)沉積而成，土壤鹽堿度較高，有良好的種植前景。

目前藥典上馬齒莧除性狀鑒別、理化鑒別外，尚無(wú)專屬性較強(qiáng)的化學(xué)對(duì)照品作為定量指標(biāo)控制其藥材質(zhì)量。有關(guān)馬齒莧中總黃酮含量測(cè)定，國(guó)內(nèi)外采用的方法一般是以蘆丁為對(duì)照的經(jīng)典NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法[7-10]。已有文獻(xiàn)報(bào)道此方法測(cè)定總黃酮專屬性差[11]，又有文獻(xiàn)報(bào)道馬齒莧中主要含有游離黃酮化合物[12]，說(shuō)明此方法并不適用于所有中草藥的總黃酮的含量測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)為尋找更理想的測(cè)定大慶地區(qū)馬齒莧總黃酮含量的方法，對(duì)黃酮類化合物的含量測(cè)定方法進(jìn)一步研究，選出最佳的含量測(cè)定方法。為完善大慶地區(qū)馬齒莧的質(zhì)量分析和開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

756MC型紫外-可見分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）；UV-7504PC紫外-可見光分光光度計(jì)（上海欣茂儀器有限公司）；KH3200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；ESJ200-4電子天平（沈陽(yáng)龍騰電子有限公司）。

1.2 試藥

蘆丁、槲皮素、山奈酚對(duì)照品（北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司）；馬齒莧（采摘自大慶市薩爾圖區(qū)）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定方法的選擇

2.1.1 樣品和對(duì)照品溶液的制備稱取大慶地區(qū)馬齒莧粉末1.0008 g，加石油醚約140 mL，用索氏提取器提取2 h至無(wú)色。藥渣轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，加入甲醇30m L，超聲提取兩次（功率70W，頻率20 kHz，溫度60℃），每次40min，過(guò)濾，濾液置于100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，再取1 mL到50mL量瓶中，加甲醇至刻度，即為樣品溶液。精密稱取蘆丁，槲皮素及山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品，分別加甲醇制成0.05 mg/mL的溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.1.2 直接掃描法取適量的樣品溶液及蘆丁、槲皮素、山奈酚對(duì)照品溶液，用甲醇空白作參比，依次于200～600 nm范圍掃描。直接掃描法的結(jié)果表明蘆丁對(duì)照品溶液的最大吸收波長(zhǎng)：260 nm和360 nm；槲皮素對(duì)照品溶液的最大吸收波長(zhǎng)：270 nm；山奈酚對(duì)照品溶液的最大吸收波長(zhǎng)：325 nm；樣品溶液的最大吸收波長(zhǎng)：340 nm和420 nm。以上四種溶液的最大吸收波長(zhǎng)各不相同。

2.1.3 Al Cl3顯色法[13]取蘆丁、槲皮素、山奈酚對(duì)照品溶液和樣品溶液各2 mL，依次置于25mL量瓶中，各加入1%的AlCl3溶液4mL，再加H2O至刻度，混勻，靜置10 min，用試劑空白作參比，依次于200～600 nm范圍掃描[14-15]。蘆丁對(duì)照品溶液的最大吸收波長(zhǎng)：360 nm；槲皮素對(duì)照品溶液的最大吸收波長(zhǎng)：420 nm；山奈酚對(duì)照品溶液的最大吸收波長(zhǎng)：420 nm；樣品溶液的最大吸收波長(zhǎng)：340 nm和420 nm。AlCl3顯色法的結(jié)果可看出在420 nm處，樣品（圖1）、槲皮素對(duì)照品（圖2）、山奈酚對(duì)照品（圖3）溶液均有最大吸收。

圖1 樣品的AlCl3顯色法掃描圖

圖2 槲皮素的AlCl3顯色法掃描圖

圖3 山奈酚的AlCl3顯色法掃描圖

2.1.4 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法分別吸取樣品溶液和蘆丁對(duì)照品溶液3 m L，各轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，分別加水到6 mL，加5%NaNO2溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加10%Al（NO3）3溶液1 mL，使混勻，靜置6 min，加10%NaOH溶液10 m L，用水稀釋至刻度，混勻，靜置15 min，用試劑空白作參比，于200～600 nm范圍掃描。NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法的結(jié)果顯示蘆丁對(duì)照品溶液的最大吸收波長(zhǎng)和樣品溶液的最大吸收波長(zhǎng)不在510 nm。所以用蘆丁作對(duì)照品測(cè)大慶地區(qū)馬齒莧中黃酮類化合物誤差大，結(jié)果不準(zhǔn)確。

通過(guò)對(duì)上述三種方法的比較，本實(shí)驗(yàn)選擇了操作簡(jiǎn)單的AlCl3顯色法，對(duì)照品選擇了價(jià)廉、對(duì)應(yīng)性好的槲皮素，并以槲皮素作為對(duì)照，對(duì)AlCl3顯色法進(jìn)行了方法學(xué)考察。

2.2 AlCl3顯色法的線性關(guān)系考察

2.2.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線將槲皮素配成6.24μg/mL的對(duì)照品溶液，分別取0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL依次置于25 mL量瓶中，各加1%AlCl3溶液4mL，分別加水至刻度，混勻，靜置10 min，用試劑空白作參比，在420 nm處測(cè)吸光度。以樣品的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=1.4224X-0.0234，r=0.9991，在0.0624～0.9984μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（圖4）。

圖4 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 精密度測(cè)試取樣品溶液適量，在420 nm處連續(xù)測(cè)定樣品溶液的吸光度5次，計(jì)算RSD=0.1%，表明儀器的精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性測(cè)試取適量的樣品溶液，在0、30、90、150、210、300 min的時(shí)間間隔內(nèi)依次測(cè)定樣品溶液的吸光度，計(jì)算RSD分別為0.1%、10.6%、13.0%、16.8%、19.0%，表明樣品溶液在30min內(nèi)較穩(wěn)定，可靠。

2.2.4 重復(fù)性測(cè)試準(zhǔn)確稱定大慶地區(qū)馬齒莧樣品粉末5份，按“2.1.1”項(xiàng)下平行制備樣品溶液。測(cè)得樣品溶液中總黃酮的平均含量為0.14%，RSD=2.99%，說(shuō)明重復(fù)性良好。

2.2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)取已知含量的大慶地區(qū)馬齒莧樣品粉末5份，按“2.1.1”項(xiàng)下平行制備樣品溶液，依次準(zhǔn)確加入適量的槲皮素對(duì)照品，結(jié)果見表1。由結(jié)果可知，該方法準(zhǔn)確、可行。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中采用直接掃描法對(duì)馬齒莧樣品溶液、蘆丁、槲皮素、山奈酚對(duì)照品在200～600 nm范圍直接掃描的結(jié)果，四種溶液的最大吸收波長(zhǎng)各不相同；采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法測(cè)定馬齒莧樣品和蘆丁對(duì)照品溶液的最大吸收波長(zhǎng)不一致。如果采用上述兩種方法測(cè)定大慶馬齒莧總黃酮的含量，顯然結(jié)果不準(zhǔn)確。而采用AlCl3顯色法測(cè)定蘆丁、槲皮素、山奈酚對(duì)照品溶液和樣品溶液的最大吸收波長(zhǎng)的結(jié)果，槲皮素、山奈酚對(duì)照品溶液和馬齒莧樣品溶液均在420 nm處有最大吸收，且對(duì)照品槲皮素價(jià)廉易得，并以槲皮素作為對(duì)照的AlCl3顯色法方法學(xué)進(jìn)行考察的結(jié)果顯示，以槲皮素作為對(duì)照的AlCl3顯色法可行。此結(jié)果與有的文獻(xiàn)指出的馬齒莧中主要含游離黃酮類化合物[12]的研究結(jié)果相一致，且AlCl3顯色法又能在420 nm條件下排除非黃酮類成分的干擾[14]。因此，對(duì)馬齒莧或大慶地區(qū)馬齒莧用比色法進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定時(shí)，建議用以槲皮素為對(duì)照的AlCl3顯色法。此方法節(jié)省試劑，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，可以成為大慶地區(qū)馬齒莧總黃酮含量測(cè)定的理想的方法。

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Exp lore of the determ ination of the content of total flavonoids from Portulaca oleaacea L.in Daqing

HAN Chenghua BAIYuhua YU Chunyue GAO Sainan YANG Luming
Harbin Medical University in Daqing,Heilongjiang Province,Daqing 163319,China

Ob jective To provide the basis for internal quality analysis of Portulaca oleaacea L.in Daqing.M ethods Portulaca oleaacea L.was degreased with ligarine,extracted total flavonoids with methanol by the ultrasonic extraction method.The content of total flavonidswas determined by AlCl3colorimetry by comparingwith quercetin.Results Comparion showed a good linear relationship at the range of 0.0624-0.9984μg/mL,regression equation was Y=1.4224X-0.0234(r=0.9991).Conclusion Themethod is simple,accurate and repetitious,which can be used in determination of the content of total flavonoids fom Portulaca oleaacea L.in Daqing.

Portulaca oleaacea L.;Total flavonoids;UV spectrophotometrymethod;AlCl3colorimetry

R284.1

A

1673-7210（2014）01（b）-0108-03

2013-11-11本文編輯：衛(wèi)軻）

黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題（編號(hào)2012-782）。

韓成花（1979.8-），女，吉林蛟河人，碩士，從事天然藥物活性成分的研究與開發(fā)。