水蛭素活性因子抗癌作用的實(shí)驗(yàn)研究

崔美月 王興福 閆懷玲

山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)科，山東濟(jì)南250001

水蛭素活性因子抗癌作用的實(shí)驗(yàn)研究

崔美月 王興福 閆懷玲

山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)科，山東濟(jì)南250001

目的觀察水蛭素活性因子對H22肝癌瘤細(xì)胞、S180肉瘤的抑制作用，為臨床用藥提供理論依據(jù)。方法取小鼠48只，每只小鼠左前腋下接種H22肝癌瘤細(xì)胞0.2 mL，隨機(jī)分為4組，每組12只，分成模型對照組、5-FU組、水蛭素活性因子大劑量組（水蛭素活性因子2.6 g/kg）和水蛭素活性因子小劑量組（水蛭素活性因子1.3 g/kg）；另取小鼠44只，每只小鼠左前腋下接種S180肉瘤細(xì)胞0.2mL，隨機(jī)分為4組，每組11只，分成模型對照組、5-FU組、水蛭素活性因子大劑量組（水蛭素活性因子2.6 g/kg）和水蛭素活性因子小劑量組（水蛭素活性因子1.3 g/kg）；連續(xù)給藥14 d，比較各組腫瘤生長情況，并計(jì)算抑瘤率。結(jié)果①水蛭素活性因子對H22肝癌實(shí)體瘤的影響：5-FU組[瘤重（0.78±0.41）g]、水蛭素活性因子大劑量組[瘤重（0.99±0.48）g]、水蛭素活性因子小劑量組[瘤重（1.15±0.50）g]對H22肝癌抑瘤率分別為58.73%、47.62%、39.15%，與模型對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），其中水蛭素活性因子大、小劑量組比較，大劑量組抑瘤作用明顯優(yōu)于小劑量組（P＜0.05），呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。②水蛭素活性因子對S180肉瘤的影響：5-FU組[瘤重（0.68±0.30）g]、水蛭素活性因子大劑量組[瘤重（0.85±0.44）g]、水蛭素活性因子小劑量組[瘤重（0.89±0.47）g]對S180肉瘤抑瘤率分別為54.67%、43.33%、40.67%，與模型對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），其中水蛭素活性因子大、小劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。③所有5-FU組小鼠在給藥第9天開始出現(xiàn)精神萎靡、蜷縮少動、脫毛、食欲減退等，而水蛭素活性因子組小鼠未發(fā)生此現(xiàn)象。結(jié)論水蛭素活性因子對H22肝癌瘤細(xì)胞和S180肉瘤均有較好的抑制作用，且水蛭素因子無明顯副作用。

水蛭素活性因子；H22肝癌瘤細(xì)胞；S180肉瘤；副作用

中藥水蛭始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有破血、逐瘀功能，臨床用于治療癓瘕積聚、血瘀閉經(jīng)、跌打損傷、血小板增多癥等[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，水蛭的活性成分是水蛭素，水蛭素是從醫(yī)用水蛭的唾液腺中提取分離得到的一種多肽，是迄今發(fā)現(xiàn)的活性最強(qiáng)的凝血酶抑制劑[2]，具有抗凝、抗血栓等作用，臨床廣泛用于治療心血管病[3-4]、腦血管病[5-6]、腎臟疾病[7]等均取得滿意療效。近年來，隨著對水蛭素研究的不斷深入，其抗腫瘤作用成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。為了進(jìn)一步探討水蛭素的抗腫瘤療效，本研究采用肝癌實(shí)體瘤和S180肉瘤小鼠模型觀察水蛭素的抑瘤效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

昆明種健康、雄性小白鼠，體重（22.0±0.5）g，由山東省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物合格證號：動管質(zhì)字（2008）第0179號。

1.1.2 細(xì)胞株

H22肝癌瘤細(xì)胞、S180肉瘤細(xì)胞瘤株，由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所細(xì)胞室提供。

1.1.3 藥品

5-氟尿嘧啶（5-FU），50 mg/片，由上海第一藥廠生產(chǎn)，批號：070816。水蛭素活性因子，由山東省醫(yī)科院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供。

1.1.4 儀器

超凈工作臺，江蘇南京科技器材開發(fā)公司生產(chǎn)；HK-Ⅱ型扭力天平，江蘇無錫凈化設(shè)備廠生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 水蛭素活性因子對H22肝癌瘤細(xì)胞的影響

1.2.1.1 腫瘤接種造模選擇腹腔接種H22肝癌實(shí)體瘤株后6～9 d、生長良好的H22肝癌小鼠，放置于超凈工作臺，腹部皮膚消毒后打開小鼠腹腔，抽取乳白色瘤液，用生理鹽水配制成含瘤細(xì)胞2×106/mL的細(xì)胞懸液。選取48只小鼠，每只小鼠左前腋下皮膚消毒后，接種H22肝癌瘤細(xì)胞懸液0.2 mL，次日開始給藥。

1.2.1.2 動物分組與用藥將接種瘤細(xì)胞后的48只小鼠，隨機(jī)法分成4組，每組12只：模型對照組、5-FU組、水蛭素活性因子大、小劑量組。模型對照組給予同體積的生理鹽水；5-FU組給予5-FU 0.15 g/kg；水蛭素大、小劑量組分別給予水蛭素活性因子2.60、1.30 g/kg。48只小鼠每日灌胃1次，每次0.5mL，連續(xù)給藥14 d，于第15天脫頸椎處死小鼠，剝離瘤塊，將瘤塊置扭力天平上稱瘤重，計(jì)算抑瘤率：（C-T）/C×100%（C為模型對照組平均瘤重，T為給藥組平均瘤重）；比較各組腫瘤生長情況；在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)密觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動、毛發(fā)、飲食等。

1.2.2 水蛭素活性因子對S180肉瘤的影響

1.2.2.1 腫瘤接種造模選擇腹腔接種S180肉瘤瘤株后6～9 d、生長良好的S180肉瘤小鼠，放置于超凈工作臺，腹部皮膚消毒后打開小鼠腹腔，抽取乳白色瘤液，用生理鹽水配制成含瘤細(xì)胞2×106/mL的細(xì)胞懸液。選取44只小鼠，每只小鼠左前腋下皮膚消毒后，接種S180肉瘤細(xì)胞懸液0.2mL，次日開始給藥。

1.2.2.2 動物分組與用藥將接種瘤細(xì)胞后的44只小鼠，隨機(jī)法分成4組，每組11只：模型對照組、5-FU組、水蛭素活性因子大、小劑量組。模型對照組給予同體積的生理鹽水；5-FU組給予5-FU 0.15 g/kg；水蛭素大、小劑量組分別給予水蛭素活性因子2.60、1.30 g/kg。44只小鼠每日灌胃1次，每次0.5mL，連續(xù)給藥14 d，于第15天脫頸椎處死小鼠，剝離瘤塊，將瘤塊置扭力天平上稱瘤重，計(jì)算抑瘤率：（C-T）/C×100%（C為模型對照組平均瘤重，T為給藥組平均瘤重）；比較各組腫瘤生長情況；在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)密觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動、毛發(fā)、飲食等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水蛭素活性因子對H 22肝癌瘤細(xì)胞的影響

各用藥組瘤重與模型對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。5-FU組、水蛭素活性因子大、小劑量組對H22肝癌抑瘤率分別為58.73%、47.62%、39.15%（P＜0.01或P＜0.05），其中，水蛭素活性因子大劑量組明顯優(yōu)于小劑量組，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。見表1。

表1 水蛭素活性因子對H22肝癌瘤細(xì)胞的影響（s）

表1 水蛭素活性因子對H22肝癌瘤細(xì)胞的影響（s）

注：與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與水蛭素活性因子小劑量組比較，#P＜0.05；5-FU：5-氟尿嘧啶;“-”表示無數(shù)據(jù)

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2.2 水蛭素活性因子對S180肉瘤的影響

各用藥組瘤重與模型對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。5-FU組、水蛭素活性因子大、小劑量組對S180肉瘤抑瘤率分別為54.67%、43.33%、40.67%（P＜0.01或P＜0.05），其中，大、小劑量水蛭素活性因子組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 水蛭素活性因子對S180肉瘤的影響（±s）

表2 水蛭素活性因子對S180肉瘤的影響（±s）

注：與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與水蛭素活性因子小劑量組比較，#P＜0.05；5-FU：5-氟尿嘧啶；“-”表示無數(shù)據(jù)

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2.3 腫瘤外觀及小鼠表現(xiàn)

接種H22肝癌瘤細(xì)胞和接種S180肉瘤細(xì)胞的小鼠，給予水蛭素活性因子治療后，其瘤塊顏色蒼白，與周圍組織粘連較少，剝離較易，出血少；模型對照組的小鼠瘤塊顏色紫暗，與周圍組織粘連較多，剝離困難，出血較多。5-FU組的抑瘤率雖然高于水蛭素活性因子大、小劑量組，但在給藥的第9天小鼠開始出現(xiàn)精神萎靡、蜷縮少動、脫毛、食欲減退等，而水蛭素活性因子大、小劑量組小鼠未發(fā)生此現(xiàn)象。

3 討論

近年來，隨著對中藥水蛭素研究的深入，水蛭素被發(fā)現(xiàn)可治療多系統(tǒng)的腫瘤。黃光武等[8]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水蛭對體外血小板聚集的抑制效果良好，對血小板聚集功能亢進(jìn)的頭頸部惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移可能有抑制作用。成軍等[9]研究發(fā)現(xiàn)，水蛭素可通過降低TRm-RNA在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)量而降低實(shí)驗(yàn)性腫瘤的轉(zhuǎn)移。王杰等[10]用復(fù)方水蛭素治療小鼠異體移植的W256腫瘤、胃癌靶細(xì)胞（NKM），結(jié)果顯示復(fù)方水蛭素對W256腫瘤和胃癌靶細(xì)胞都有明顯的抑制作用。賀彬等[11]研究顯示，水蛭素對人舌鱗癌細(xì)胞株TCA8113細(xì)胞生長呈抑制作用。譚祥華等[12]研究顯示，活血化瘀法對腫瘤作用機(jī)制為全方位、多靶點(diǎn)作用，活血化瘀類中藥可通過改善血液流變學(xué)，降低血液黏度，調(diào)節(jié)癌基因及其信號傳遞，抑制血管生成以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡等方式來抑制腫瘤細(xì)胞生長，阻斷腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移。水蛭素是從活血化瘀代表藥水蛭中提取的有效物質(zhì)，它對上述多系統(tǒng)腫瘤的作用，也證實(shí)了其全方位、多靶點(diǎn)作用。目前，臨床上西醫(yī)治療腫瘤副作用大，給腫瘤的治療帶來了局限性，而中藥由于療效好、副作用少而在臨床腫瘤治療方面占有一定優(yōu)勢。本研究結(jié)果也顯示，水蛭素活性因子能顯著抑制小鼠H22肝癌實(shí)體瘤和S180肉瘤，且未發(fā)現(xiàn)明顯的副作用；而5-FU組在給藥的第9天小鼠開始出現(xiàn)精神萎靡、蜷縮少動、脫毛、食欲減退等副作用。因此，水蛭素作為新的抗腫瘤藥物，因其抗腫瘤作用強(qiáng)、副作用少而在臨床治療腫瘤方面將發(fā)揮更大的作用。

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Experimental study of anti-tum or effect of hirudin active factor

CUIMeiyue WANG Xingfu YAN Huailing
Departmentof Internal Medicine,the Second Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Shandong Province,Ji'nan 250001,China

Ob jective To observe the anti-tumor effect of hirudin active factor on H22 liver tumor cells and S180 sarcoma,thus to provide theoretical basis for clinical pharmacy.M ethods 48 mice were selected,0.2mL H22 liver tumor cells inoculated subcutaneously,divided into 4 groups,each group had 12 mice.Four groups were named as control group,5-FU group,high-dose hirudin group(hirudin active factor 2.6 g/kg),low-dose hirudin group(hirudin active factor 1.3 g/kg).Another 44 mice were selected,0.2 mL S180 sarcoma cell inoculated subcutaneously,divided into 4 groups,each group had 11 mice.Four groups were named as control group,5-FU group,high-dose hirudin group (hirudin active factor 2.6 g/kg),low-dose hirudin group(hirudin active factor 1.3 g/kg).Allmicewere treated by saline, 5-FU group,high-dose hirudin,low-dose hirudin respectively for 14 days daily.The growth of carcinoma cell were compared,and the anti-carcinoma ratewas calculated.Results①The effect of hirudin active factor on H22 solid liver cancer:the anti-carcinoma rates of 5-FU group[tumor weight(0.78±0.41)g],high-dose hirudin group[tumor weight (0.99±0.48)g],low-dose hirudin group[tumor weight(1.15±0.50)g]to H22 solid liver cancer were 58.73%,47.62% and 39.15%respectively,had obvious difference compared to control group(P＜0.01 or P＜0.05);and the anti-carcinoma rate of high-dose hirudin group was obviously higher than the low-dose hirudin group(P＜0.05),which showed dose-effect relationship.②The effect of hirudin active factor on S180 sarcoma cell:the anti-carcinoma rates of 5-FU group[tumor weight(0.68±0.30)g],high-dose hirudin group[tumor weight(0.85±0.44)g],low-dose hirudin group[tumorweight(0.89±0.47)g]to S180 sarcoma cellwere 54.67%,43.33%and 40.67%respectively,had obvious difference compared to control group(P＜0.01 or P＜0.05);and the difference of anti-carcinoma rate was not obvious between high-dose hirudin group and low-dose hirudin group(P＞0.05).③All themice of 5-FU group gotmalaise,curled up, hair slip and eat less on day 9,themice of hirudin active factor group were escapable of those phenomena.Conclusion Hirudin active factor can restrain the growth of H22 liver tumor cells and S180 sarcoma obviously,and which has no side effect.

Hirudin active factor;H22 liver tumor cells;S180 sarcoma;Side effect

R285.5

A

1673-7210（2014）01（b）-0008-03

2013-10-23本文編輯：程銘）

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號ZR2009CM 092）。

崔美月（1964.12-），女，吉林汪清人，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合臨床內(nèi)科疾病的診療工作，尤其擅長呼吸及腫瘤疾病的診治。