RNA干擾HPV E6下調(diào)eIF4E轉(zhuǎn)錄表達(dá)抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖并影響細(xì)胞周期進(jìn)程研究

王 森 高 敏 趙 毅 朱 偉 姜恩平 康海仙 姚運(yùn)紅 胡新榮

1.廣東醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所病理教研室，廣東廣州523808；2.廣東省東莞市人民醫(yī)院病理科，廣東東莞523059

RNA干擾HPV E6下調(diào)eIF4E轉(zhuǎn)錄表達(dá)抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖并影響細(xì)胞周期進(jìn)程研究

王 森1高 敏2趙 毅1朱 偉1姜恩平1康海仙1姚運(yùn)紅1胡新榮1

1.廣東醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所病理教研室，廣東廣州523808；2.廣東省東莞市人民醫(yī)院病理科，廣東東莞523059

目的探討宮頸癌Hella細(xì)胞中干擾HPV E6對(duì)eIF4E表達(dá)的調(diào)控，探尋HPV E6促癌的新途徑，為宮頸癌診斷和治療提供新靶點(diǎn)。方法構(gòu)建高效的靶向HPV18 E6的shRNA質(zhì)粒（shE6）并測序，而后轉(zhuǎn)染人宮頸癌Hela細(xì)胞，熒光顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率。而后以Real-time PCR檢測E6及eIF4E的mRNA水平，采用CCK-8法檢測Hela細(xì)胞增殖能力的改變，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。結(jié)果測序結(jié)果顯示成功構(gòu)建shE6質(zhì)粒。shE6-3轉(zhuǎn)染人宮頸癌Hela細(xì)胞后48 h，E6及eIF4E mRNA表達(dá)的抑制率分別約為80%，76%。shE6-3對(duì)Hela細(xì)胞的增殖活性在48 h的抑制效果最明顯，增殖抑制率約為21%；相對(duì)于NC組，shE6組G0/G1期細(xì)胞比例顯著增高，而S期比例減少，G2/M期未見明顯變化。結(jié)論RNA干擾HPV E6能夠下調(diào)eIF4E轉(zhuǎn)錄表達(dá)，抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖，并阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期。eIF4E有望成為宮頸癌防治的潛在靶點(diǎn)。

宮頸癌；E6；真核細(xì)胞翻譯起始因子；RNA干擾

真核細(xì)胞翻譯起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）是新近發(fā)現(xiàn)的原癌基因，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。eIF4E是帽依賴性翻譯起始必需的且起限速作用的翻譯啟始因子，被認(rèn)為是控制真核細(xì)胞翻譯的主要開關(guān)之一。人eIF4E基因定位于染色體4q21～q25，編碼24 kD的多肽。盡管eIF4E在控制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的蛋白翻譯的作用已被證實(shí)，其表達(dá)調(diào)控至今不明，特別是在特定腫瘤如鼻咽癌、宮頸癌等病毒密切相關(guān)腫瘤中的調(diào)節(jié)機(jī)制有待更深入研究。目前，eIF4E與宮頸癌關(guān)系的研究尚處于起步階段。國內(nèi)尚未見宮頸癌中調(diào)控eIF4E表達(dá)的報(bào)道。本研究利用RNA干擾技術(shù)探討了HPV E6對(duì)eIF4E轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控作用，有助于闡明eIF4E及E6致癌的機(jī)制，為宮頸癌診斷和治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基本材料CCK-8試劑盒購自上海生工，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司，胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，eIF4E抗體購自Santacruz。

1.1.2 細(xì)胞本研究采用HPV+的宮頸癌Hella細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基（RPMI 1640）。

1.1.3 質(zhì)粒E6的shRNA干擾質(zhì)粒（shE6）由上海吉?jiǎng)P公司構(gòu)建完成。其中，三對(duì)shRNA框架序列分別為E6-shRNA-1（stem：CCTACAAGCTACCTGATCT，loop：AGTGAAGCCACAGATGTA，stem：AGATCAGGTAGCTTGTA GG），E6-shRNA-2（stem：GGAACTTACAGAGGT ATTT，Loop：AGTGAAGCCACAGATGTA，stem：AAATA CCTCTG TAAGTTCC），E6-shRNA-3（stem：GCAGAGAAACACAAGTATA，loop：AGTGAAGCCACAGATGTA，stem：TATACTTGTGTTTCTCTGC）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為三組：MOCK組（即：未處理Hela細(xì)胞組），NC組（即：空白質(zhì)粒組），shE6組（即：shRNA干擾E6組，包括E6的三種干擾質(zhì)粒shE6-1、shE6-2、shE6-3）。

1.2.2 qRT-PCR檢測宮頸癌細(xì)胞HPV E6及e IF4E mRNA表達(dá)HPV18 E6、eIF4E及GAPDH引物由長沙艾杰生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。HPV18 E6引物序列為：forward5′-CGAACCGTTGAATCCAGCAGAA-3′，reverse5′-CGAACCGTTGAATCCAGCAGAA-3′。eIF4E引物序列為：forward5′-CTGCGGCTGATCTCCAAG-3′，reverse5′-CTGCGGCTGATCTCCAAG-3′。GAPDH引物序列為：forward5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3′，reverse5′-CCTGGAAGATGGTGATG GGATT-3′。RT-PCR反應(yīng)中每20微升反應(yīng)體系加1μL模板DNA，其反應(yīng)條件設(shè)定如下：95℃，1min，95℃，30 s，30循環(huán)，54℃，30 s，72℃，7 min。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整密度為2.5×104/mL，100μL/孔接種于96孔板，每孔加入10μL CCK-8溶液繼續(xù)孵育2 h，全自動(dòng)酶標(biāo)議上測吸光度值。細(xì)胞生長抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值／對(duì)照組吸光度值）×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期已處理細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后，0.25%胰酶消化1 min，加等量培養(yǎng)基終止反應(yīng)后1500 r/min離心5min，棄上清，PBS洗2次后70%預(yù)冷乙醇固定，4℃保存過夜。上機(jī)前離心去除乙醇，冷PBS洗2遍，將細(xì)胞重懸于0.2 m L冷PBS中，加0.6 mL PI，4℃避光染色30min。400目尼龍網(wǎng)過濾后使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間差異采用單因素方差分析，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 E6-shRNA質(zhì)粒有效干擾宮頸癌Hela細(xì)胞E6 mRNA的表達(dá)

本研究構(gòu)建了靶向E6的shRNA質(zhì)粒，命名為shE6（圖1）。然后，將shE6轉(zhuǎn)染人宮頸癌Hela細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染12、24、36、48 h的細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下可見細(xì)胞中有綠色熒光表達(dá)，說明轉(zhuǎn)染成功，可進(jìn)行轉(zhuǎn)染后操作（圖2，見封三）。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)GFP表達(dá)，在轉(zhuǎn)染shE6 24、48 h后，shE6組GFP表達(dá)率分別為17.2%、41.6%（圖3），較對(duì)照組差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；表明Lipofectamine TM 2000能有效將shE6轉(zhuǎn)染入宮頸癌Hela細(xì)胞中。

2.2 沉默E6后Hela細(xì)胞eIF4E的表達(dá)相應(yīng)下調(diào)

ShE6轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞48 h后，NC與MOCK組相比，E6mRNA的表達(dá)水平基本一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），shE6-1～3均有明顯的干擾作用，其中以shE6-3組抑制效率最高，抑制率約為80%（P＜0.001）（圖4 A）。Real-Time PCR結(jié)果表明，shE6作用Hela細(xì)胞48 h后，NC組與MOCK組相比，eIF4E mRNA的表達(dá)水平基本一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；shE6-1～3作用48 h后對(duì)eIF4EmRNA的表達(dá)均有明顯的干擾作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中以shE6-3對(duì)eIF4E mRNA的表達(dá)抑制效率最高，抑制率約為76%（P＜0.001）（圖4 B）。

2.3 高效shE6抑制了宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期進(jìn)程

采用CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后24、48、72 h后對(duì)Hela細(xì)胞的增殖活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染shE6-3后能明顯抑制Hela細(xì)胞的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖5）。

收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，結(jié)果見表1，相對(duì)于MOCK組，NC組細(xì)胞各周期無明顯變化（P＞0.05）。而轉(zhuǎn)染shE6-3后，相對(duì)于MOCK組，細(xì)胞G0/G1期比例明顯增加；G2/M期比例無明顯變化（P＞0.05）。提示，轉(zhuǎn)染shE6-3作用于Hela細(xì)胞后使細(xì)胞DNA合成下降（S期細(xì)胞分布比例降低），細(xì)胞生長停滯于G0/G1期，抑制Hela細(xì)胞的增殖。

圖1 sh E6測序結(jié)果顯示質(zhì)粒構(gòu)建正確

圖3 流式細(xì)胞儀下shE6轉(zhuǎn)染后GFP表達(dá)

圖4 shE6轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞導(dǎo)致E6及e IF4Em RNA表達(dá)下降

圖5 shE6-3對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響

表1 shE6-3轉(zhuǎn)染后Hela細(xì)胞的周期百分比分布（%）

3 討論

eIF4E是新近發(fā)現(xiàn)的原癌基因，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-3]。eIF4E又稱帽結(jié)合蛋白，能特異識(shí)別mRNA的帽結(jié)構(gòu)，調(diào)控mRNA翻譯的諸多關(guān)鍵步驟，如在細(xì)胞質(zhì)中參與mRNA向43s起始復(fù)合物的轉(zhuǎn)運(yùn)以形成48s復(fù)合物，并幫助解開mRNA 5，非翻譯區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)等。在細(xì)胞核內(nèi)eIF4E則選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)特殊mRNA，如VEGF、cyclinD1和ODC到細(xì)胞質(zhì)而不影響看家基因mRNA。研究發(fā)現(xiàn)，eIF4E在宮頸癌癌、頭頸部鱗癌等多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，并且與其發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-5]。腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)的eIF4E能打開長而高度結(jié)構(gòu)化的5UTRs序列，大大提高了弱mRNA的表達(dá)，產(chǎn)生促進(jìn)細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)化及血管生成的調(diào)節(jié)蛋白如c-myc、p53、cyclinD1、TGF-β、VEGF、MMP9、Bcl-2等參與癌的形成和轉(zhuǎn)移[6-10]。然而，盡管eIF4E在控制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的蛋白翻譯的作用已被證實(shí)，其表達(dá)調(diào)控至今不明，特別是在特定腫瘤如鼻咽癌、宮頸癌等病毒密切相關(guān)腫瘤中的調(diào)節(jié)機(jī)制有待更深入研究。

目前，eIF4E與宮頸癌關(guān)系的研究尚處于起步階段。Van Tranppen等[11]應(yīng)用RT-PCR方法在宮頸癌組織中檢測到eIF4E的高表達(dá)，據(jù)此推斷eIF4E參與了宮頸癌的發(fā)生并對(duì)疾病的發(fā)展產(chǎn)生重要影響。Lee等[12]應(yīng)用免疫組化法發(fā)現(xiàn)在90%正常宮頸鱗狀上皮組織中未檢測到eIF4E的表達(dá)，隨著宮頸上皮病變級(jí)別的升高，eIF4E表達(dá)逐漸增強(qiáng)。他們推斷eIF4E的表達(dá)是宮頸癌變的早期改變，可能與正常宮頸上皮的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。然而，上述研究多局限于初步探索，迄今為止，eIF4E與宮頸癌關(guān)系的研究仍然極少，且eIF4E在宮頸癌中高表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。

宮頸癌發(fā)病率居女性惡性腫瘤的第2位，僅次于乳腺癌。盡管其具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，然而已有研究表明，HPV感染是引起宮頸癌及其癌前病變的必要因素，幾乎所有的宮頸癌組織均可檢測到HPVDNA[13-14]。其中，HPV表達(dá)的E6蛋白是其最重要的致癌分子之一。該蛋白由151個(gè)氨基酸殘基組成，含有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)含有2個(gè)C-X-X-C序列。E6是高危型HPV的一個(gè)重要的致癌基因，它在致癌過程中的發(fā)揮了重要作用，可通過直接或間接途徑與各種靶蛋白相互作用，如通過抑制P53和PDZ蛋白家族的活性，以及增強(qiáng)端粒酶的活性等致癌[15-16]。綜合上述背景本研究推測宮頸癌中eIF4E高表達(dá)也極有可能源于HPV E6等源頭癌基因的活化作用。目前未見宮頸癌源頭癌基因如E6等對(duì)eIF4E表達(dá)調(diào)控的研究及eIF4E對(duì)宮頸癌細(xì)胞水平的作用報(bào)道。本研究探討了HPV E6對(duì)eIF4E轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控作用，有助于闡明eIF4E在宮頸癌中過表達(dá)及E6致癌的新機(jī)制，為宮頸癌診斷和治療提供新靶點(diǎn)。本研究提示，E6能夠通過增強(qiáng)eIF4E基因表達(dá)而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程和遷移，抑制凋亡。研究表明，E6通過一系列復(fù)雜機(jī)制調(diào)控眾多癌基因的蛋白表達(dá)發(fā)揮最終效應(yīng)。而eIF4E屬于帽式翻譯限速因子，eIF4E的活化直接促進(jìn)相關(guān)癌基因的mRNA翻譯，這使得E6通過作用于eIF4E發(fā)揮促癌功能成為有效且便捷的途徑。然而，迄今為止，尚極少有eIF4E對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)影響的報(bào)道。本研究將E6轉(zhuǎn)染HPV-宮頸癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)eIF4E表達(dá)隨之升高，細(xì)胞增殖加快且凋亡減少。抑制HPV陽性腫瘤細(xì)胞中eIF4E表達(dá)的表達(dá)則表現(xiàn)出細(xì)胞增殖抑制且細(xì)胞周期阻滯等特點(diǎn)，這些結(jié)果提示eIF4E很可能參與了HPV致癌、促癌的主要環(huán)節(jié)。因此，eIF4E可能是HPV致癌關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，是宮頸癌防治的潛在靶點(diǎn)。

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Study of RNA interference of HPV E6 down regulates the transcripiton of eIF4E and inhibits the cell proliferation and cell cycle of Hela cells

WANG Sen1GAOMin2ZHAO Yi1ZHUWei1JIANG Enping1KANG Haixian1YAO Yunhong1HU Xinrong1
1.Departmentof Cancer Institute and Pathology,Guangdong Medical College,Guangdong Province,Guangzhou 523808, China;2.Department of Pathology,the People′s Hospital of Dongguan,Guangdong Province,Dongguan 523059,China

Ob jective To investigate RNA interference of E6 could regulate eIF4E in cervical cancer cells and to find new target gene for the diagnosis and therapy of cervical cancer.Methods ShRNAs of E6 were constructed by company and transfected into Hela cells.The transfection rate was detected by fluorescence microscope and flowcytometry (FCM).Real time PCR was used to detected mRNA of E6 and eIF4E.CCK-8 was employed for cell proliferation and FCM was used to detected the cell cycle.Resu lts ShRNA plasmids of E6 were constructed successfully and transfected into Hela cells.48 h later,themRNA of E6 and eIF4E were 80%,76%,respectively.ShE6-3 leaded to the inhibition of cell proliferation(21%)at 48 h.In the cell cyle detection,the cells of G0/G1phase increased highly while the cells of S phase decreased.The cells of G2/M phase was the same to that of the control group.Conclusion ShE6 can inhibit the cell proliferatin of cervical cancer and can down regulate the transcription of eIF4E,block the cell cycle on G0/G1, whichmightbe a potenitial target for cervical cancer.

Cervical cancer;E6;Eukaryotic cells and translation initiation;RNA interference

R737.33

A

1673-7210（2014）01（b）-0004-04

2013-11-15本文編輯：衛(wèi)軻）

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)81302244）；廣東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)S2012040006383）；廣東省醫(yī)學(xué)基金立項(xiàng)課題（編號(hào)B2013293）；廣東省高等學(xué)校科技創(chuàng)新（重點(diǎn)）項(xiàng)目（編號(hào)2012KJCX0057）。

王森（1983.1-），男，博士；研究方向：腫瘤病理學(xué)與腫瘤分子生物學(xué)。

胡新榮（1962.8-），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師；研究方向：腫瘤病理學(xué)與腫瘤分子生物學(xué)。