類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液抑制間充質(zhì)干細(xì)胞增殖

蔣志瓊，唐 中，譚 竟，吳碧華

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1.老年科，2.檢驗(yàn)科，3.風(fēng)濕科，四川南充637000)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有自我更新和多向分化潛能的非造血干細(xì)胞，不僅來(lái)源廣泛，體外培養(yǎng)增殖迅速，而且除具有支持體外造血、促進(jìn)體內(nèi)造血重建、組織損傷修復(fù)外還具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)作用［1］，為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)的治療帶來(lái)了新的應(yīng)用前景。但是，已有的研究［2］發(fā)現(xiàn)MSCs 在RA 動(dòng)物模型體內(nèi)并沒(méi)有發(fā)揮預(yù)期的免疫負(fù)調(diào)節(jié)和損傷組織修復(fù)作用，這是否與RA 的炎性環(huán)境致MSCs 生物學(xué)特性改變有關(guān)呢?故對(duì)此作一相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 材料:1)試劑:LG-DMEM 培養(yǎng)液(GIBCO 公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace 組合型(成都博瑞克生物技術(shù)有限公司)，成人骨髓MSCs 成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)。2)標(biāo)本:骨髓標(biāo)本來(lái)源于14 例健康志愿者。關(guān)節(jié)液來(lái)源于活動(dòng)期RA 患者，共5 例，病程均超過(guò)10年。標(biāo)本收集獲得本單位倫理委員會(huì)的審查批準(zhǔn)及本人的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 骨髓MSCs 的分離培養(yǎng):采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法，取P3 代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RA 關(guān)節(jié)液對(duì)MSCs 增殖的影響:將MSCs 以相同的數(shù)量(約4 000 個(gè)/孔)接種于96 孔板。實(shí)驗(yàn)組MSCs 培養(yǎng)液中分別加入10%、30%和50% 濃度的RA 關(guān)節(jié)液上清，對(duì)照組不加。培養(yǎng)5 d 后采用MTT 法檢測(cè)各孔吸光度值(absorbance，A 值)。

1.2.3 RA 關(guān)節(jié)液對(duì)MSCs 凋亡的影響:將MSCs 以相同的數(shù)量(約105個(gè)/孔)接種于6 孔板，實(shí)驗(yàn)組MSCs 培養(yǎng)液中加入50%濃度的RA 關(guān)節(jié)液上清，對(duì)照組不加。培養(yǎng)5 d 后消化收獲各組細(xì)胞，采用凋亡試劑盒流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組凋亡情況。

1.2.4 RA 關(guān)節(jié)液對(duì)MSCs 成骨誘導(dǎo)的影響:將MSCs 以相同的數(shù)量(約105個(gè)/孔)接種于6 孔板。實(shí)驗(yàn)組MSCs 培養(yǎng)液中加入50% RA 患者關(guān)節(jié)液上清，設(shè)空白對(duì)照。培養(yǎng)5 d后開(kāi)始加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液誘導(dǎo)，每3 天完全換液1 次，共誘導(dǎo)7 d。茜素紅染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)的形成，RT-PCR 檢測(cè)成骨細(xì)胞特異性產(chǎn)物骨橋蛋白基因的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 MSCs 的生長(zhǎng)特性和形態(tài)學(xué)觀察:14 例標(biāo)本均成功分離培養(yǎng)得到MSCs。MSCs 原代培養(yǎng)7～12 d 可鋪滿瓶底達(dá)80%以上，傳代后細(xì)胞增殖更迅速，P3 代5～7 d 即可長(zhǎng)滿瓶底達(dá)80%以上，細(xì)胞形態(tài)均勻一致。至P5 代，MSCs 的增殖逐漸變慢，并出現(xiàn)胞體變大，突起增多的老化現(xiàn)象。

2.2 RA 患者關(guān)節(jié)液對(duì)MSCs 增殖的影響:加入RA 患者關(guān)節(jié)液培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組MSCs，當(dāng)關(guān)節(jié)液濃度為10%時(shí)的A 值為0.234 ±0.029，30%時(shí)為0.227 ±0.065，50% 時(shí)為0.194 ±0.059，顯著低于對(duì)照組的0.269 ±0.047。

2.3 RA 患者關(guān)節(jié)液對(duì)MSCs 凋亡的影響:流式細(xì)胞儀分析顯示經(jīng)50% RA 患者關(guān)節(jié)液作用后的實(shí)驗(yàn)組MSCs 的凋亡比例為41.53%，與對(duì)照組的45.5%接近。

2.4 RA 患者關(guān)節(jié)液對(duì)MSCs 成骨誘導(dǎo)的影響:50% RA 患者關(guān)節(jié)液培養(yǎng)5 d 的MSCs，經(jīng)成骨誘導(dǎo)7 d 后與對(duì)照組相比，產(chǎn)生的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量更多且體積更大(圖1)。實(shí)驗(yàn)組MSCs 經(jīng)成骨誘導(dǎo)7 d 后就明顯可見(jiàn)骨橋蛋白基因的表達(dá)，而對(duì)照組MSCs 骨橋蛋白基因的表達(dá)量還很少(圖2)。

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制目前并未真正明確，傳統(tǒng)的治療方法仍需發(fā)展。生物制劑的應(yīng)用為RA 的治療帶來(lái)了新的希望，但治療費(fèi)用昂貴、易發(fā)生各種感染，且僅能控制或阻止疾病的進(jìn)展，當(dāng)關(guān)節(jié)畸形后，無(wú)法修復(fù)軟骨及骨的破壞，因而有待尋求更好的治療方法。

圖1 MSCs 成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色示意圖Fig 1 MSCs alizarin red staining after osteogenesis induction(×100)

圖2 RT-PCR 示骨橋蛋白基因的表達(dá)Fig 2 RT-PCR in the expression of osteopontin gene

MSCs 兼具免疫調(diào)節(jié)與組織修復(fù)功能，有望成為RA 新的治療手段。目前有研究［3］發(fā)現(xiàn)RA 滑液中的炎性環(huán)境可使定居于滑液纖維間質(zhì)中的自身MSCs 數(shù)量降低，并會(huì)影響其功能的發(fā)揮，使其軟骨形成能力受損，且新生軟骨也可能被降解。但是RA 患者的炎性環(huán)境對(duì)外源性的MSCs 又有何影響呢?本研究發(fā)現(xiàn)RA 患者的炎性關(guān)節(jié)液可導(dǎo)致健康者M(jìn)SCs 的增殖減慢，但是不會(huì)引起其凋亡增加。更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)關(guān)節(jié)液作用后的MSCs，其向成骨細(xì)胞分化的速度明顯加快了。目前研究認(rèn)為MSCs 向成骨細(xì)胞分化，一般要2～3 周才能檢測(cè)到骨橋蛋白基因的表達(dá)。而經(jīng)關(guān)節(jié)液作用7 d 的MSCs 經(jīng)誘導(dǎo)1 周后就可見(jiàn)骨橋蛋白基因的表達(dá)，而此時(shí)未予關(guān)節(jié)液處理的MSCs 其骨橋蛋白基因的表達(dá)量是很弱的。因此認(rèn)為RA 患者關(guān)節(jié)液抑制外源性MSCs 的增殖，可能是由于促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化，因而是可以對(duì)RA的骨破壞提供治療作用的。

［1］Tyndall A，Walker UA，Cope A，et al.Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells:a review based on an interdisciplinary meeting held at the Kennedy Institute of Rheumatology Division，London，UK，31 October 2005［C］.Arthritis Res Ther，2007，9:301-301.

［2］Greish S，Abogresha N，Abdel-Hady Z，et al.Human umbilical cord mesenchymal stem cells as treatment of adjuvant rheumatoid arthritis in a rat model［J］.World J Stem Cells，2012，4:101-109.

［3］Jones E，Churchman SM，English A，et al.Mesenchymal stem cells in rheumatoid synovium:Enumeration and functional assessment in relation to synovial inflammation level［J］.Ann Rheum Dis，2010，69:450-457.