CDMP1轉(zhuǎn)基因間充質(zhì)干細(xì)胞片修復(fù)兔軟骨缺損

崔 穎，姚 梅，胡 晶，李俊霞，王 宇，張 本

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，遼寧錦州121000)

創(chuàng)傷與疾病引起的軟骨缺損的修復(fù)是臨床耳鼻咽喉頭頸外科及骨科醫(yī)師所面臨的難題。組織工程技術(shù)被認(rèn)為是目前解決軟骨缺損問題的有效手段。傳統(tǒng)的組織工程技術(shù)將種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合構(gòu)建工程化軟骨來修復(fù)軟骨缺損，但因其細(xì)胞利用率低、支架降解所帶來的纖維化和非特異性炎性反應(yīng)限制了組織工程學(xué)的發(fā)展。細(xì)胞片技術(shù)(cell sheet technology，CST)利用溫控材料收獲培養(yǎng)的細(xì)胞片，避免了酶的消化作用，保留了大量的連接蛋白和生長因子，通過重疊構(gòu)建出多層立體組織細(xì)胞片，其結(jié)構(gòu)更加類似于天然軟骨，在心肌、角膜和口腔黏膜等多學(xué)科領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用［1-3］，但在軟骨重建方面的探索甚少，且對于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞片的研究尤為罕見。本研究擬從基因水平和蛋白水平探討軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白-1(cartilage derived morphogenetic protein-1，CDMP1)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞片修復(fù)兔軟骨缺損的能力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

新西蘭大白兔2.0～3.0 kg，雌雄不限(遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。L-DMEM 培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(Hyclone 公司);重組hCDMP1 腺病毒液(賽業(yè)生物科技，廣州);溫度敏感性培養(yǎng)皿(Nunc 公司);PLL 和胰蛋白酶(Sigma 公司);SYBR Primx Ex Taq Ⅱ?qū)崟r(shí)染料試劑盒、PAGE 級純化的引物、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和蛋白質(zhì)Marker(大連寶生物有限公司);兔抗人CDMP1 多克隆抗體和兔抗人Ⅱ型膠原多克隆抗體(Abcam 公司);RIPA 裂解液(強(qiáng))、PMSF 和Tween-20(碧云天生物技術(shù)研究所);免疫組化試劑盒(中山金橋公司)。

1.2 方法

1.2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs)的分離培養(yǎng):采用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)耳緣靜脈麻醉，常規(guī)消毒鋪巾，于雙側(cè)股骨近端作骨髓穿刺(注射器內(nèi)含0.2 mL 的肝素鈉200 U/mL)，抽取骨髓3～4 mL，立即入超凈工作臺按照密度梯度離心法收集兔BMSCs，接種于含10%胎牛血清的L-DMEM 完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，3 d 后首次換液，以后每隔2～3 d 換液，至細(xì)胞匯合度達(dá)80%～85%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，1∶2 傳代。

1.2.2 CDMP1 基因轉(zhuǎn)染BMSCs:取相應(yīng)病毒液以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)50、100、150和200 分別轉(zhuǎn)染6 孔板中的BMSCs，每孔再加入2 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育過夜，PBS 漂洗充分，給予含10%胎牛血清(FBS)的L-DMEM 培養(yǎng)基2 mL 繼續(xù)培養(yǎng)2～5 d。倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞形態(tài)，以不引起明顯CPE 效應(yīng)的最大MOI 值作為攜帶目的基因腺病毒的最佳MOI 值。

1.2.3 細(xì)胞片的制備:將第4 代兔BMSCs 分為3 組(表1)，按MOI=100 轉(zhuǎn)染BMSCs，24 h 后更換培養(yǎng)液為5%的完全培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)7～14 d，同期培養(yǎng)對照組BMSCs。將各組細(xì)胞以6×108/cm2的密度接種于9.6 cm2的溫度敏感性6 孔板上，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 d，待其生長基本匯合，取出置于20 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育，細(xì)胞逐步從培養(yǎng)皿底壁分離，15 min 后細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)一起脫落形成完整的細(xì)胞片層。

表1 實(shí)驗(yàn)分組Table 1 Groups of experiments

1.2.4 Real time PCR 檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞片CDMP1的表達(dá):收集各組細(xì)胞片，用Trizol 提取總RNA，按照SYBR 熒光燃料法試劑盒進(jìn)行RT 反應(yīng)，得到的cDNA 采用Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System 25 μL 體系兩步法進(jìn)行反應(yīng)。程序如下所述:Stage 1 預(yù)變性:95 ℃30 s;Stage 2 PCR 反應(yīng):95 ℃5 s 60 ℃34 s/40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)基因每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，引物序列見表2。

1.2.5 Western blot 檢測細(xì)胞片中CDMP1 的表達(dá):收集上述3 組細(xì)胞片，常規(guī)方法制樣與BCA 定量，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，行封閉、洗膜后分別與兔抗人CDMP1 多克隆抗體雜交過夜。膜經(jīng)徹底洗滌后，與羊抗兔二抗進(jìn)行雜交，顯影，照相。

表2 Real time PCR 引物序列Table 2 The sequence of primer

1.2.6 工程化細(xì)胞片的制備:按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程(Standard Operating Protocol，SOP)法收集單孔的細(xì)胞片，用聚偏氟乙烯膜(Polyvinylidene Fluoride，PVDF)小心地將此單層細(xì)胞片轉(zhuǎn)移至另一已棄掉培養(yǎng)基的孔中，讓載有細(xì)胞片的那一面與孔底壁的細(xì)胞相接觸，保證無氣泡和緊密貼合，然后在PVDF 膜上滴入1 mL 的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞片從PVDF 膜上分離開后取出PVDF 膜繼續(xù)培養(yǎng)，反復(fù)重復(fù)此步驟則可以收集到多層疊加的組織工程細(xì)胞片［4］。

1.2.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.7.1 甲狀軟骨缺損動(dòng)物模型的建立:將兔隨機(jī)分為3 組，每組4 只，耳緣靜脈注射3%的戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，固定體位，常規(guī)消毒，鋪無菌洞巾。頸前正中縱形切口，分離皮下及肌層，暴露甲狀軟骨，于左側(cè)做1 個(gè)0.5 cm×0.5 cm 全層軟骨缺損，不穿透喉黏膜，詳細(xì)步驟參考《組織工程學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》［5］。

1.2.7.2 組織工程細(xì)胞片的移植:將上述3 組已制備好的組織工程細(xì)胞片小心地移植至兔甲狀軟骨缺損處，生物膠稍黏合邊緣固定，7-0 無損傷線逐層縫合黏膜、肌層，1 號線關(guān)閉切口、消毒、敷貼覆蓋。術(shù)后24 h 密切觀察動(dòng)物呼吸、活動(dòng)及進(jìn)食情況，常規(guī)喂養(yǎng)高蛋白飼料，每日給予青霉素160 萬單位肌注，連續(xù)應(yīng)用5 d，術(shù)后7～9 d 拆線，分別于術(shù)后4 和8 周每組各處死2 只兔，行移植部位工程化軟骨的大體和組織石蠟切片觀察。

1.2.7.3 移植部位工程化軟骨的Ⅱ型膠原蛋白免疫組化和阿新藍(lán)染色:石蠟切片經(jīng)二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、不同梯度的乙醇脫蠟至水后，PBS 漂洗3 次，每次5 min;1% (V/V)阿利新藍(lán)工作液染色20～30 min，0.05 mol/L HCl 漂洗2 s;核固紅染液復(fù)染5 min，自來水流水沖洗2 min;晾干、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。石蠟切片經(jīng)二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、不同梯度的乙醇脫蠟至水后，內(nèi)源性過氧化物酶封閉，一抗工作液，37 ℃孵育30 min;加入二抗抗體，濕盒4 ℃過夜;DAB 顯色，顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用IPP6.0 進(jìn)行圖像分析，應(yīng)用SPSS16.0 軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與CDMP1 基因轉(zhuǎn)染

原代培養(yǎng)的BMSCs，24 h 內(nèi)可見有細(xì)胞貼壁，首次換液后，可見貼壁細(xì)胞呈短梭形、三角形，有細(xì)胞小集落形成，5～7 d 呈典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)，10～12 d 細(xì)胞連成片，呈魚群狀排列。轉(zhuǎn)染CDMP1基因的細(xì)胞熒光閃亮，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)80%(圖1)。

圖1 第1 代BMSCs 及轉(zhuǎn)染CDMP1 基因72 h 的BMSCs 形態(tài)Fig 1 Appearance of BMSCs of passage 1 after culturing for 24 hours and BMSCs appearance after transfecting by CDMP1 for 72 hours(×200)

2.2 細(xì)胞片的觀察

溫度敏感性培養(yǎng)皿獲得的細(xì)胞片結(jié)構(gòu)完整、呈白色薄膜狀，有一定韌性和可操作性，相差顯微鏡下見細(xì)胞緊密連接，細(xì)胞間基質(zhì)固縮，胞間距消失，形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞呈短梭形，邊界不清。多層疊加的細(xì)胞片貼合緊密，韌性增加，其三維形態(tài)更立體(圖2)。

2.3 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞片CDMP 的表達(dá)鑒定

2.3.1 Real time PCR 法檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞片CDMP的表達(dá):CDMP1 基因和GAPDH 基因的擴(kuò)增率基本一致(圖3A);通過比較2－△△Ct值，7500 software v2.0.5 軟件自動(dòng)計(jì)算統(tǒng)計(jì)值并給出直方圖(圖3B)，此直方圖很直觀地表現(xiàn)了3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間的差異(P＜0.05)。

2.3.2 Western blot 檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞片CDMP 的表達(dá):實(shí)驗(yàn)組A 出現(xiàn)分子質(zhì)量大小約13 ku 的明顯電泳條帶(與hCDMP1 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量相符合)，而實(shí)驗(yàn)組B 和實(shí)驗(yàn)組C 則無電泳條帶顯示，內(nèi)參β-actin大小約43 ku(圖4)。

2.4 細(xì)胞片修復(fù)軟骨缺損的效果評估

2.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察:術(shù)后6～8 h 即可進(jìn)食，無呼吸困難、無異?；顒?dòng)，24 h 后基本恢復(fù)正常，體質(zhì)量無明顯下降，頸部切口一期愈合，植入物無脫出，無異物及免疫反應(yīng)。

圖2 單層及多層疊加培養(yǎng)的BMSCs 細(xì)胞片的觀察Fig 2 BMSCs cell sheet of monolayer and trilaminar

圖3 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞片CDMP 的表達(dá)鑒定Fig 3 Identification of the expression of CDMP1 in transfected BMSCs cell sheets

圖4 CDMP1 蛋白在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞片中的表達(dá)Fig 4 The expression of CDMP1 protein in transfected BMSCs cell sheets

2.4.2 工程化軟骨術(shù)后觀察:術(shù)后4 周創(chuàng)面均未見明顯感染及壞死表現(xiàn)。A 組創(chuàng)面色澤淡紅，表面稍欠光滑，基本與周圍軟骨平齊。B 組和C 組創(chuàng)面凹陷較明顯，邊界清晰;術(shù)后8 周觀察創(chuàng)面:A 組創(chuàng)面稍顯灰白，有軟骨樣改變，表面尚光滑，邊界模糊不清。B 組和C 組動(dòng)物創(chuàng)面淡紅，稍凹陷，質(zhì)地較軟，與周圍正常軟骨界限清晰(圖5)。

2.4.3 術(shù)后8 周的組織工程化軟骨的組織學(xué)檢測:術(shù)后8 周的實(shí)驗(yàn)組A 的工程化軟骨中可見大量類軟骨細(xì)胞生成，Ⅱ型膠原蛋白免疫組化和阿新藍(lán)染色陽性，B 組和C 組基本為纖維瘢痕組織代替、少許肌肉組織填充，Ⅱ型膠原蛋白免疫組化和阿新藍(lán)染色基本呈陰性(表3，圖6)。

表3 各實(shí)驗(yàn)組Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)和GAG 吸光度分析Table 3 Expression of type Ⅱcollagen protein and intensity analysis of GAG for different groups(±s，n=4)

表3 各實(shí)驗(yàn)組Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)和GAG 吸光度分析Table 3 Expression of type Ⅱcollagen protein and intensity analysis of GAG for different groups(±s，n=4)

＊P＜0.05 compared with control.

grouptype Ⅱcollagen proteinGAG A 8 655 ±1 66515 046 ±1 915 B 9 516 ±30415 767 ±483 C19 250 ±902*28 196 ±749*

3 討論

圖5 工程化軟骨術(shù)后觀察Fig 5 Observation of acquired engineered cartilages

圖6 各實(shí)驗(yàn)組Ⅱ型膠原蛋白和GAG 的表達(dá)Fig 6 Expression of type Ⅱcollagen protein and GAG for different groups(×200)

細(xì)胞片技術(shù)具有以下生物學(xué)特性［6］:1)良好的生物相容性;2)合適的機(jī)械強(qiáng)度和理想的操作性;3)細(xì)胞接種率高、基質(zhì)豐富、具有多樣化;4)可量化控制，可根據(jù)需要構(gòu)建大小和厚度，構(gòu)建的組織更接近于正常組織。其基本原理是采用溫敏培養(yǎng)皿［7］來構(gòu)建細(xì)胞片，通過它的兩性溫敏特征［8］無創(chuàng)收獲完整的細(xì)胞片，避免了酶解法，保留了關(guān)鍵的細(xì)胞表面蛋白、生長因子受體和細(xì)胞連接蛋白，使其更接近于天然細(xì)胞組織，目前該項(xiàng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于構(gòu)建牙周韌帶、皮膚、血管和角膜等組織［1-3］，其在眼球表面再生［9-10］、心肌修補(bǔ)［11］以及牙周組織再生［7，12-13］等方面應(yīng)用成熟。目前細(xì)胞片工程中所采用的細(xì)胞多為BMSCs、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞，對于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞片的研究鮮有報(bào)道。

CDMP-1 是近年來發(fā)現(xiàn)的一種多肽生長因子［14］，它具有特異的軟骨誘導(dǎo)能力，主要表達(dá)于胚胎的前軟骨基質(zhì)聚集區(qū)及發(fā)育長骨中的軟骨核心，可以誘導(dǎo)軟骨形成。目前國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)嘗試對其體外移植及治療軟骨缺損和畸形的潛能進(jìn)行研究，并在其修復(fù)骨、肌腱、韌帶等組織方面已獲得了一些成果［15］。但是外源添加CDMP-1 不僅費(fèi)用昂貴，而且生物利用度低，起效時(shí)間短。

在以上研究工作的基礎(chǔ)上，嘗試著提出假說:與BMSCs 細(xì)胞片相比，CDMP 轉(zhuǎn)染的BMSCs 細(xì)胞片是否具有更好的軟骨修復(fù)能力?能夠更加有效地修復(fù)局部軟骨的缺損?因此，在實(shí)驗(yàn)中嘗試采用腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將CDMP 轉(zhuǎn)染入BMSCs中，誘導(dǎo)成功后，利用溫度敏感性培養(yǎng)皿收獲獨(dú)立的細(xì)胞片，并通過三層疊加構(gòu)建工程化的三維細(xì)胞片，進(jìn)而移植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，分別從大體和組織學(xué)上探討細(xì)胞片修復(fù)兔軟骨缺損的能力并對其進(jìn)行鑒定。本研究嘗試將基因工程、干細(xì)胞及細(xì)胞片技術(shù)結(jié)合起來探討軟骨重建及再生的可能，以期為軟骨組織工程提供一個(gè)新途徑和方法。

CDMP1 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞片組的RQ 值明顯高于轉(zhuǎn)染陰性組和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞片組，Western blot 檢測到CDMP1 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞片組在13 ku 有條帶表達(dá)，而B、C 組則無相應(yīng)條帶表達(dá)，從基因和蛋白水平上證實(shí)了轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)技術(shù)的成功性。術(shù)后4 周和8 周所獲得的工程化軟骨，從大體觀察，A 組創(chuàng)面平整，有類軟骨樣細(xì)胞生成，與周圍正常組織界限模糊，Ⅱ型膠原免疫組化和阿利新藍(lán)染色均呈陽性，而B、C 組基本為纖維組織和肌肉組織充填，凹陷較明顯，邊界清晰，Ⅱ型膠原免疫組化和阿利新藍(lán)染色陰性，表明轉(zhuǎn)染CDMP1 的BMSCs 細(xì)胞片具有較好的成軟骨分化活性，能有效修復(fù)兔軟骨的缺損。

本實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞片技術(shù)與基因工程、組織工程相結(jié)合，采用腺病毒轉(zhuǎn)染CDMP1 至兔BMSCs 中，利用溫度敏感性培養(yǎng)皿成功構(gòu)建出轉(zhuǎn)基因細(xì)胞片，避免了傳統(tǒng)方法中胰蛋白酶的消化損害作用，保護(hù)了細(xì)胞表面重要的蛋白，使細(xì)胞的向軟骨分化活性得以更大程度的保留，在Ⅱ型膠原和GAG 的表達(dá)上更接近于天然軟骨，有效地促進(jìn)了兔軟骨缺損的修復(fù)。由于實(shí)驗(yàn)條件限制，本實(shí)驗(yàn)體內(nèi)修復(fù)軟骨缺損的觀察時(shí)間較短，長期修復(fù)效果是否滿意仍需近一步觀察，我們會(huì)在今后的后續(xù)研究中對此進(jìn)一步探討。

雖然，細(xì)胞片技術(shù)目前尚處于發(fā)展初期，缺乏長期臨床觀察，仍有大量問題亟待解決，但是，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞片克服了傳統(tǒng)組織工程中支架的異質(zhì)反應(yīng)、可降解、纖維化等弊端，又能夠提高細(xì)胞向某一方向的定向分化能力，具有廣泛的應(yīng)用前景，有望為組織工程開辟一條新的道路。

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