長(zhǎng)葉獼猴桃初始無(wú)菌組培體系建立

蔡冬元（湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410127）

長(zhǎng)葉獼猴桃初始無(wú)菌組培體系建立

蔡冬元
（湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410127）

長(zhǎng)葉獼猴桃（Actinidia hemsleyana Dunn.）屬獼猴桃科獼猴桃屬，為多年生纏繞類(lèi)大型落葉藤本植物。雌雄異株，葉片大多呈長(zhǎng)披針形[1-2]。果實(shí)富含維生素、氨基酸和微量元素，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕之功效[1-4]。葉、根含許多生物活性物質(zhì)和其他醫(yī)藥成分，對(duì)早期快速生長(zhǎng)的腫瘤具有明顯抑制作用[5-6]。雖然長(zhǎng)葉獼猴桃在市場(chǎng)與醫(yī)藥方面發(fā)展前景廣闊，但自然資源并不十分豐富，加上采挖強(qiáng)度大，致使資源日趨減少[7]。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)并快速推廣長(zhǎng)葉獼猴桃優(yōu)良品系，擴(kuò)大種群數(shù)量，具有重要的意義。當(dāng)前有關(guān)獼猴桃組織培養(yǎng)的報(bào)道較多，但主要集中于食用獼猴桃種類(lèi)及其種質(zhì)資源保存方面的研究，尚未見(jiàn)長(zhǎng)葉獼猴桃無(wú)菌組培體系建立的研究報(bào)道[8]。該項(xiàng)目對(duì)長(zhǎng)葉獼猴桃初始無(wú)菌組培體系建立進(jìn)行了探究，旨在為長(zhǎng)葉獼猴桃組培苗的生產(chǎn)和工廠化快速繁育種苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

該試驗(yàn)在湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院植物組織培養(yǎng)中心進(jìn)行。研究所需外植體材料取自湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院藤本植物資源圃。

2012年3月25日、10月12日及2013年3月25日分別從長(zhǎng)葉獼猴桃植株上剪取當(dāng)年抽發(fā)的半木質(zhì)化或已木質(zhì)化的新梢，選取新梢上的帶芽莖段、葉柄、剛展開(kāi)的幼嫩葉片小塊作外植體。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

1.2.1.1 外植體的預(yù)處理。①將半木質(zhì)化或已半木質(zhì)化的新梢剪成2.5～3.0 cm長(zhǎng)帶芽莖段置于燒杯中，在自來(lái)水中沖洗30 min。②將展開(kāi)的新葉剪成4～9 cm2的離體小塊置于燒杯中，在自來(lái)水中沖洗30 min。③收集葉柄并置于燒杯中，在自來(lái)水中沖洗30 min。

1.2.1.2 外植體的消毒處理。將在自來(lái)水下沖洗好的材料瀝干水分，置于超凈工作臺(tái)上，帶芽莖段與葉柄分別用75%酒精浸泡8 s→無(wú)菌水洗1次→用0.1%升汞消毒10 min→無(wú)菌水洗7次。

離體葉片小塊分別用75%酒精浸泡4 s→無(wú)菌水洗1次→用0.1%升汞消毒7 min→無(wú)菌水洗7次。

1.2.1.3 外植體的分割與接種。將經(jīng)過(guò)消毒處理后的莖段切成1.0～1.5 cm長(zhǎng)的帶芽莖段，接種至相關(guān)培養(yǎng)基中；將葉片分割成1.0 cm2大小，接種至相關(guān)培養(yǎng)基中；將消毒葉柄的陳舊傷口切割后接種至相關(guān)培養(yǎng)基中。

1.2.2 雙因子試驗(yàn)方法。2012年3月25日、2012年10月12日、2013年3月25日分別以長(zhǎng)葉獼猴桃的芽帶莖段、葉片、葉柄作外植體展開(kāi)了三次雙因子重復(fù)試驗(yàn)。長(zhǎng)葉獼猴桃NAA、6-BA的雙因子試驗(yàn)見(jiàn)表1。

表1 長(zhǎng)葉獼猴桃NAA與6-BA的雙因子試驗(yàn)

在3個(gè)時(shí)間段開(kāi)展雙因子重復(fù)試驗(yàn)時(shí)，按照上述配方，各配培養(yǎng)基1 L，分裝至33個(gè)培養(yǎng)瓶中。每種外植體各接種11瓶。將接種好的帶芽莖段置于初始培養(yǎng)室中給予5 d暗光培養(yǎng)，后逐漸增加光照時(shí)間與光照強(qiáng)度。將接種好的葉柄置于初始培養(yǎng)室中給予10 d暗光培養(yǎng)，后逐漸增加光照時(shí)間與光照強(qiáng)度。將接種后的葉片小塊置于初始培養(yǎng)室中給予10 d暗光培養(yǎng)，后逐漸增加光照時(shí)間與光照強(qiáng)度。培養(yǎng)室中溫度為（25±2）℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 帶芽莖段重復(fù)對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

2012年3月25日、10月12日及2013年3月25日分別利用長(zhǎng)葉獼猴桃的帶芽莖段作處植體進(jìn)行為期30 d的雙因子重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明：①2012年3月25日及2013年3月25日選取的帶芽莖段在上述9個(gè)培養(yǎng)基中，相比在B培養(yǎng)基中即MS＋6-BA 1.00 mg/L＋NAA 0.10 mg/L有最好表現(xiàn)。②莖上側(cè)芽在誘導(dǎo)培養(yǎng)后6 d即開(kāi)始萌動(dòng)，至30 d新梢生長(zhǎng)健壯，且傷口處出現(xiàn)大量愈傷組織。③2012年10月12日所選取的帶芽莖段在B培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述相應(yīng)時(shí)間后也有較好表現(xiàn)，但整體表現(xiàn)不如2012年3月25日及2013年3月25日所取帶芽莖段的試驗(yàn)結(jié)果（表2、圖1）。

2.2 新葉小塊重復(fù)對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

2012年3月25日、10月12日及2013年3月25日分別利用長(zhǎng)葉獼猴桃的新葉小塊作外植體進(jìn)行為期30 d的雙因子重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明：①2012年3月25日及2013年3月25日選取的葉塊在上述9個(gè)培養(yǎng)基中，相比在A培養(yǎng)基中即MS＋6-BA 0.50 mg/L＋NAA 0.10 mg/L有最好表現(xiàn)。②暗培養(yǎng)10 d后至初始培養(yǎng)30 d，此時(shí)的葉塊膨大，葉塊面積明顯大于接種時(shí)的葉面積；葉塊邊緣出現(xiàn)了明顯的愈傷組織。③2012年10月12日所選取的新葉小塊在A培養(yǎng)基中也有較好表現(xiàn)，但整體表現(xiàn)不如2012年3月25日及2013年3月25日的試驗(yàn)結(jié)果（表2、圖2）。

2.3 葉柄重復(fù)對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

2012年3月25日、10月12日及2013年3月25日分別利用長(zhǎng)葉獼猴桃的葉柄作外植體進(jìn)行為期30 d的雙因子重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明：葉柄在三次雙因子重復(fù)試驗(yàn)中，培養(yǎng)期間動(dòng)態(tài)變化不明顯（表2）。

3 結(jié)論與討論

（1）長(zhǎng)葉獼猴桃的帶芽莖段在B培養(yǎng)基即MS＋6-BA1.00 mg/L＋NAA0.10 mg/L中表現(xiàn)最佳；新葉小塊在A培養(yǎng)基即MS＋6-BA0.50 mg/L＋NAA0.10 mg/L中表現(xiàn)最佳。

（2）在長(zhǎng)葉獼猴桃生長(zhǎng)最旺盛的春季選取半木質(zhì)化或已木質(zhì)化的帶芽莖段、剛展開(kāi)的新葉作外植體，組培效果比進(jìn)入秋季時(shí)選取相應(yīng)器官作外植體好。

（3）在以往的關(guān)于獼猴桃的組培試驗(yàn)、研究與獼猴桃組培苗的生產(chǎn)中，以帶芽莖段作外植體建立初始培養(yǎng)體系常見(jiàn)，尚未見(jiàn)利用葉片作外植體的研究報(bào)道。此次研究與重復(fù)對(duì)比試驗(yàn)中充分利用了新葉作外植體，且已利用其成功建立起了長(zhǎng)葉獼猴桃初始無(wú)菌組培體系。利用葉片作外植體比利用帶芽莖段作外植體，“種子”資源更豐富，可將對(duì)母本植株的生長(zhǎng)影響與傷害降至最低。

表2 培養(yǎng)30 d時(shí)各外植體生長(zhǎng)情況比較

圖1 帶芽莖段在B培養(yǎng)基中的表現(xiàn)

圖2 葉塊在A培養(yǎng)基中的表現(xiàn)

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（責(zé)任編輯 張楊林）

Establishment on Asepsis Tissue Culture System of Actinidia hemsleyana

[目的]建立長(zhǎng)葉獼猴桃初始無(wú)菌培養(yǎng)體系。[方法]以長(zhǎng)葉獼猴桃的帶芽莖段、葉柄和葉片為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，展開(kāi)三次雙因子重復(fù)試驗(yàn)。[結(jié)果]長(zhǎng)葉獼猴桃?guī)а壳o段在MS＋6-BA 1.00 mg/L＋NAA 0.10 mg/L培養(yǎng)基中初始培養(yǎng)效果好；離體葉片小塊在MS＋6-BA 0.50 mg/L＋NAA 0.10 mg/L培養(yǎng)基中初始培養(yǎng)效果好。[結(jié)論]為長(zhǎng)葉獼猴桃組培苗的生產(chǎn)和工廠化快速繁育種苗奠定了基礎(chǔ)。

長(zhǎng)葉獼猴桃；初始無(wú)菌組培體系；建立

CAI Dong-yuan(Hunan Biological and Electromechanical Polytechnic,Changsha,Hunan 410127)

[Objective]The aim was to establish an asepsis tissue culture system of Actinidia hemsleyana. [Method]Taking the stem with shoots,leafstalks and leaves of Actinidia hemsleyana Dunn.as explants and MS medium as the basic medium,the thrice double factors repeated experiment was carried out.[Result]The best initial medium for the stem with shoot of Actinidia hemsleyana was MS＋6-BA 1.00 mg/L＋NAA 0.10 mg/L; MS＋6-BA 0.50 mg/L＋NAA 0.10 mg/L was the best initial medium for leaf segments of Actinidia hemsleyana in vitro.[Conclusion]The results laided a foundation for somaclone production and factory rapid breeding seedlings of Actinidia hemsleyana.

Actinidia hemsleyana;Asepsis tissue culture system;Establishment

Q943

A

2095-0896（2014）06-012-03

湖南農(nóng)業(yè)廳一般項(xiàng)目：獼猴桃組培苗快繁配套技術(shù)研究與應(yīng)用（2012NY0015）。

蔡冬元（1964-），女，湖南益陽(yáng)人，從事苗木生產(chǎn)技術(shù)方面課程的教學(xué)與研究，E-mail：caidongyuan911@126.com。

2014-04-13