尋常型銀屑病皮損中血管緊張素II及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的檢測

蔡艷霞蔡川川樊翌明張錫寶

·短篇論著·

尋常型銀屑病皮損中血管緊張素II及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的檢測

蔡艷霞1蔡川川1樊翌明1張錫寶2

目的: 檢測尋常型銀屑病皮損中血管緊張素II(AngII)及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的水平變化。方法: 應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ－PCR)和免疫組化技術(shù)檢測30例尋常型銀屑病患者(進(jìn)行期17例,靜止期13例)皮損Ang II和ACEmRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果: 銀屑病患者皮損中Ang II和ACE mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯高于正常人對照組(P＜0.001),且進(jìn)行期高于靜止期(P＜0.001)。結(jié)論: Ang II和ACE在銀屑病皮損中表達(dá)上調(diào),推測可能與銀屑病皮損中新血管的形成有關(guān)。

銀屑??； 血管緊張素II； 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶

銀屑病是一種常見的慢性易復(fù)發(fā)炎癥性皮膚病,新生血管形成是銀屑病重要的病理特征之一。1近年有學(xué)者對腎素－血管緊張素系統(tǒng)(rennin－angiotensin system,RAS)在皮膚組織的表達(dá)進(jìn)行了研究,Ang II可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子VEGF表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致新生血管形成、血管通透性增加,曾有報道使用血管緊張素受體拮抗劑及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑可誘發(fā)或加重銀屑病病情。2,3本研究通過檢測尋常型銀屑病患者皮損中Ang II和ACE mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平,進(jìn)而明確兩者與尋常型銀屑病發(fā)病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 研究病例 2009年1～9月在我院門診及廣州市皮膚病防治所就診的尋常型銀屑病患者30例,均經(jīng)臨床與組織病理檢查確診,其中男18例,女12例,年齡16～73歲,平均39歲,病程1個月～10余年。銀屑病患者的皮損面積和嚴(yán)重程度按PASI評分為4.2～33.7分,平均13.45±6.42分。所有銀屑病患者近3個月內(nèi)未系統(tǒng)服用維A酸﹑糖皮質(zhì)激素﹑免疫抑制劑等藥物,2周內(nèi)未使用任何外用藥物。

1.1.2 標(biāo)本收集 所有患者常規(guī)皮損活檢,取材部位為腰背部及四肢。對照組15個標(biāo)本來源于我院整形外科門診手術(shù),其中男8名,女7名,年齡與銀屑病患者組相當(dāng),均排除銀屑病且無系統(tǒng)性疾病和其他皮膚病。

1.2 檢測方法

1.2.1 熒光定量PCR(FQ－PCR) 應(yīng)用FQ－PCR檢測30例尋常型銀屑病患者皮損(進(jìn)行期17例,靜止期13例)和15名正常人皮膚中Ang II、ACE mRNA的表達(dá)情況。

1.2.1.1 FQ－PCR引物探針設(shè)計 序列如下Sequence Name:H－Ang II(77 bp)；Forward Primer:5'－GCCACTATGGGCTGTCTACACA－3'；Reverse Primer:5'－TGGCTGAAGCAATCTTACATAGGT－3'；Probe:5'－FAM－TATGGAATACCGCTGGCCCTTTGGC－TAMRA－3'；Sequence Name:H－ACE(68 bp)；Forward Primer:5'－CCGAAATACGTGGAACTCATCAA－3'；Reverse Primer:5'－CACGAGTCCCCTGCATCTACA－3'；Probe:5'－FAM－CAGGCTGCCCGGCTCAATGG－TAMRA－3'。

1.2.1.2 組織RNA的提取 組織塊置勻漿器,加TRIZol(Invitrogen公司)1 mL,冷凍勻漿,依據(jù)說明書上的步驟提取RNA。

1.2.1.3 RNA樣品鑒定 濃度計算:每樣品在紫外分光光度計(日本SHIMADZU UV mini 1240)上測定波長為260 nm時的吸光度值。濃度計算公式:濃度(g/ L)＝OD260×稀釋倍數(shù)(120倍)×40/1000。

1.2.1.4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取4μLRNA模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),儀器為PE9700PCR儀(美國Perkin Elmer公司),反應(yīng)體系如下:5×逆轉(zhuǎn)錄buffer 4μL；上游引物(10 pM/μL)0.4μL；下游引物(10 pM/μL)0.4μL；dNTPs(25 mM)0.2μL；MMLV(10 U/μL)1μL；DEPC水10μL；RNA模板4μL；總體積:20μL；(逆轉(zhuǎn)錄buffer成分:50 mM Tris－HCl(pH 8.0),50 mM KCl,4 mM MgCl2,10 mM DTT)。反應(yīng)條件:37℃1 h,95℃3 min。

1.2.1.5 熒光定量PCR反應(yīng) 樣本按以下反應(yīng)體系進(jìn)行:5×定量PCR buffer(美國ABI公司)10μL；上游引物F(10 pM/μL)1μL；下游引物R(10 pM/μL)1 μL；dNTPs(25 mM)(Sigma公司)0.5μL；熒光探針(10 pM/μL)1μL；Taq酶(美國ABI公司)1.5μL；cDNA 5μL；ddH2O 30μL；總體積:50μL。

PCR buffer成分:10 mM Tris－HCl(pH 8.0),50 mM KCl,2mM MgCl2；反應(yīng)條件為:93℃2 min,93℃45 s,55℃45 s,共40循環(huán)。

1.2.2 免疫組化SABC法檢測Ang II、ACE蛋白的表達(dá)情況 倒置OLYPUS顯微鏡攝像:應(yīng)用KONTRON IBAS 2.5(德國)全自動圖像分析系統(tǒng),參照文獻(xiàn)4所提供的免疫組化的定量方法,應(yīng)用ZEISS Axiotron研究型顯微鏡,每張切片選取5個具有代表性的100倍視野,測出測試區(qū)域A的灰度級GA和面積(m＋n)及陽性反應(yīng)產(chǎn)物α相的灰度Gα和面積n。計算各視野陽性指數(shù)(positive unit,PU),PU＝100×｜Gα－GA｜/〔(1－AAa)Gmax〕,其中Gmax為圖像分析系統(tǒng)的最大灰度級(其值為256),以平均值作為該標(biāo)本的陽性系數(shù)值進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)用(ˉx±s)表示,應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。統(tǒng)計學(xué)方法包括t檢驗、t'檢驗和直線相關(guān)分析,組間比較均先進(jìn)行正態(tài)性檢驗,若資料不符合正態(tài)分布,則應(yīng)用非參數(shù)檢驗,求相關(guān)系數(shù)(r)并作顯著性檢驗。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 銀屑病患者皮損細(xì)胞內(nèi)Ang IImRNA的表達(dá)水平明顯高于正常對照者中的表達(dá)水平(P＝0.002),見表1。

2.2銀屑病患者皮損細(xì)胞內(nèi)ACE mRNA的表達(dá)水平明顯高于正常對照者中的表達(dá)水平(P＝0.002),見表2。

2.3 Ang II蛋白及ACE蛋白在銀屑病皮損及正常對照組皮膚中的表達(dá) 尋常型銀屑病患者皮損中Ang II及ACE蛋白含量較對照組明顯增高(P＜0.001)；進(jìn)行期與靜止期患者皮損的Ang II及ACE蛋白表達(dá)差異有顯著性(P＜0.001),見表3。

表1 銀屑病皮損和正常人皮膚內(nèi)Ang IImRNA的表達(dá)

表2 銀屑病皮損和正常人皮膚內(nèi)ACE mRNA的表達(dá)

表3 Ang II、ACE蛋白在銀屑病各組和正常組中的表達(dá)

3 討論

近年來有報道Ang II及ACE與銀屑病的發(fā)病有關(guān),5在人表皮細(xì)胞(角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞、表皮成纖維細(xì)胞和表皮血管內(nèi)皮細(xì)胞)均有Ang II受體的表達(dá),Ang II對各種表皮細(xì)胞的增殖和分化起重要作用。6本研究發(fā)現(xiàn)在銀屑病患者皮損血管內(nèi)皮細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中均表達(dá)Ang II,尤其是基底層及棘細(xì)胞層高度表達(dá),表達(dá)量高于正常人。目前認(rèn)為Ang II通過促進(jìn)VEGF、內(nèi)皮素－1、前列腺素D2等分子的表達(dá)而增加血管通透性,引起內(nèi)皮細(xì)胞增殖并有新血管形成,從而誘發(fā)或加重銀屑病。2,3至于Ang II及VEGF在銀屑病中表達(dá)量的相關(guān)性及與其他致炎因子之間的相互作用有待進(jìn)一步研究。本次實驗表明,銀屑病患者皮損中的ACE表達(dá)顯著高于正常人,且進(jìn)行期和靜止期表達(dá)量差異有顯著性,表明ACE與銀屑病病情輕重程度具有相關(guān)性。ACE是皮膚炎癥如銀屑病或過敏性皮炎的重要監(jiān)控因子,7能有效控制皮膚感覺神經(jīng)末稍釋放的神經(jīng)肽,并清除這些神經(jīng)肽類物質(zhì)和生長因子的蛋白裂解產(chǎn)物,銀屑病皮損區(qū)神經(jīng)支配密度高于非皮損區(qū)及正常對照,且神經(jīng)纖維顯著增長,P物質(zhì)含量顯著增高。8進(jìn)而誘導(dǎo)致炎因子的釋放,ACE作為這些致炎因子及神經(jīng)肽類物質(zhì)的監(jiān)控因子,其水平隨之也增高。

1 Creamer JD,Barker JN.Vascular proliferation and angiogenic factors in psoriasis.Clin Exp Dermatol,1995,20(1):6－9.

2 Antonor D,Grozdev I,Pehlivanov G,et al.Psoriatic erythroderma associated with enalapril.Skinmed,2006,5(2):90－92.

3 Cohen AD,Bonneh DY,Reuveni H,et al.Drug exposure and psoriasis vulgaris:case－control and case－crossover studies.Acta Derm Venereol,2005,85(4):299－303.

4申洪.免疫組織化學(xué)染色定量方法研究(III).中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,1995,4(1):89－91.

5Cambien F,Alhence－Gelas F,Herbeth B,et al.Familial resemblance of plasma angiotensin－converting enzyme level:the Nancy Study.Am JHum Genet,1998,43(5):774.

6 Das UN.Is angiotensin－IIan endogenous pro－inflammatorymolecule.Med SciMonit,2005,11(5):155－162.

7 Scholzen TE,Luger TA.Neutral endopeptidase and angiotensinconverting enzyme－key enzymes terminating the action of neuroendocrinemediators.Exp Dermatol,2004,13(Suppl,4):22－26.

8Eedy DJ,Johnston CF,Shaw C,etal.Neuropeptides in psoriasis:an immunocytochemical and radioimmunoassay study.Invest Dermatol,1991,96(4):43－48.

(收稿:2012－10－31 修回:2013－04－15)

The expression of angiotensin II and angiotensin converting enzyme in patien tsw ith psoriasis

CAIYan-xia,CAIChuan-chuan,Fan Yi-ming,et al.Guangdong Medical College Affiliated Hospital,Guangdong,Zhanjiang,524001

Objective:To detect the level of angiotensin II(Ang II)and angiotensin converting enzyme (ACE)in patientswith psoriasisvulgaris.Methods:The levelof Ang IIand ACEwas detected by fluorescent quantitative polymerase chain reaction(FQ－PCR)and immunohistochemistry technique in 30 patients with psoriasis vulgaris(progressing stage in 17 cases and stable stage in 13)and 15 normal controls.Results:The level of Ang IIand ACE protein was significantly higher in psoriatic lesions than in controls(P＜0.001)and in progressing stage higher than in stable stage(P＜0.001).Conclusion:Over expression of Ang IIand ACE in psoriatic lesionsmay be implicated in the neovascularization of psoriasis.

psoriasis；angiotensin II；angiotensin converting enzyme

1廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科,廣東湛江,524001

2廣州市皮膚病防治所,廣東廣州,510095