綠原酸對深靜脈血栓形成大鼠T細胞亞群失衡的影響

劉禮青，王德華，王 彬，李 霞，田楠楠

實驗研究

綠原酸對深靜脈血栓形成大鼠T細胞亞群失衡的影響

劉禮青1，2，王德華3，王 彬4，李 霞1，田楠楠5

目的：探討Th1/Th2亞群失衡在大鼠深靜脈血栓形成（DVT）中的作用及綠原酸的作用機制。方法：40只DVT大鼠隨機分為DVT模型組、綠原酸小劑量組、綠原酸中劑量組、綠原酸大劑量組，每組各10只，分離大鼠脾臟單核細胞，流式細胞術(shù)檢測各組大鼠Th1亞群（CD4+TNF-α+）、Th2亞群（CD4+IL-4+）比例，ELISA法檢測大鼠外周血IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10水平，并分析Th1/Th2比例與血清炎癥標記物相關(guān)性。結(jié)果：與正常組及假手術(shù)組比較，DVT模型組大鼠脾臟Th1亞群比例升高（22.71±0.87，%），Th2亞群比例降低（3.06±0.15，%），Th1/Th2升高（7.20±0.45），IL-2、TNF-α表達升高（72.10±7.48，173.50±17.02, pg/mL），IL-4、IL-10表達降低（347.46±11.24、28.55±1.78,pg/mL）；與模型組比較，綠原酸大劑量組大鼠Th1亞群比例降低（14.38±0.41,%），Th2亞群比例升高（4.91±0.14,%），Th1/Th2降低（3.02±0.26），IL-2、TNF-α表達降低（50.22±4.06、110.22±10.32, pg/mL），IL-4、IL-10表達升高（418.72±15.32、9.32±2.83,pg/mL），綠原酸大劑量組療效優(yōu)于中、小劑量組（P＜0.05）；Th1/Th2比例與IL-2、TNF-α呈正相關(guān)，與IL-4、IL-10呈負相關(guān)。結(jié)論：大鼠DVT發(fā)病過程中存在Th1/Th2亞群失衡，綠原酸誘導T細胞向Th2亞群偏移，逆轉(zhuǎn)Th1/Th2亞群失衡狀態(tài)，進而減輕炎癥反應，抑制血栓形成。

綠原酸；Th1/Th2亞群；深靜脈血栓形成；細胞因子

機體免疫機制紊亂在深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）發(fā)病中的作用日益受到關(guān)注。T細胞是機體免疫調(diào)節(jié)的主導，不同T細胞亞群產(chǎn)生不同細胞因子，形成復雜的細胞因子譜系，發(fā)揮核心的免疫調(diào)節(jié)作用[1]。Th1/Th2亞群是經(jīng)典的T細胞亞群，在抵抗病原體感染及維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用，參與了多種疾病的發(fā)生與發(fā)展[2-3]。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，DVT大鼠及患者存在Th1型細胞因子表達升高，Th1/Th2失衡參與了DVT的發(fā)生與發(fā)展[4]。綠原酸是中藥茵陳的主要有效成分，具有抗氧化作用及免疫調(diào)節(jié)等作用[5-6]。本實驗通過建立大鼠DVT模型，觀察模型大鼠Th1/Th2亞群變化，闡釋其在DVT發(fā)病中的作用，并觀察綠原酸干預后DVT大鼠Th1/Th2亞群分化狀態(tài)及其特征性細胞因子的表達，闡釋綠原酸逆轉(zhuǎn)Th1/Th2失衡治療DVT的作用與關(guān)鍵機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 Wistar大鼠60只，12周齡，體質(zhì)量200～250 g，雄性，SPF級，購自山東大學實驗動物中心（許可證號SCXK魯20090001）。自由飲水和攝食，室溫25～26℃，相對濕度45%左右。定期紫外線室內(nèi)消毒，適應性飼養(yǎng)7 d。綠原酸原料藥（南京海陵中藥制藥工藝技術(shù)國家工程研究中心，純度95.0%；批號060801）。生理鹽水由山東華魯制藥有限公司生產(chǎn)，批準文號國藥準字H37022750。大鼠抗小鼠熒光抗體FITC-CD4、PE-TNF-α、PE-IL-4購自美國BD Pharmigen公司，IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10ELISA試劑盒購自美國BD R＆D公司。

1.2 DVT大鼠模型建立 根據(jù)Reyers法建立大鼠DVT模型40只，隨機數(shù)字表法分為綠原酸大中小劑量[(40、20、10)mg·kg-1]組與模型組，各10只。造模術(shù)后動物自飲水攝食，綠原酸生理鹽水溶液連續(xù)灌胃7 d。模型組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)處理7 d。假手術(shù)組大鼠麻醉后分離下腔靜脈但不予結(jié)扎，直接縫合腹膜、皮膚，術(shù)后給予生理鹽水連續(xù)灌胃7 d。正常大鼠作為正常對照組，給予生理鹽水連續(xù)灌胃7 d。

1.3 標本收集與Th1、Th2亞群檢測 末次藥物處理后次日，大鼠心臟取血，分離血清，無菌分離大鼠脾臟，針栓研磨制成單細胞懸液，200目銅網(wǎng)過濾，調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL，加入佛波酯（PMA）30 μg/L、離子霉素（Ionomycin）1 mg/L、莫能霉素（Monensin）1.7 μg/L，37℃，5%CO2孵育4 h。收集細胞，1×PBS洗2遍，去上清，加入小鼠血清，室溫避光孵育30 min。將外標抗體FITC-CD4按說明書加入到細胞懸液中，4℃避光孵育30 min。1×PBS洗2遍，去上清。BD固定穿膜試劑盒固定穿膜（按說明書操作），加入內(nèi)標抗體（PE-TNF-α、PE-IL-4），4℃避光孵育30 min；穿膜緩沖液洗2次，去上清，PBS重懸細胞，轉(zhuǎn)管，上機檢測。Winmidin 2.9分析Th1（CD4+TNF-α+）及Th2（CD4+IL-4+）亞群比例。

1.4 Th1/Th2亞群特征性細胞因子檢測 采用ELISA法檢測血清Th1型細胞因子IL-2、TNF-α及Th2型細胞因子IL-4、IL-10蛋白表達，按照試劑盒說明操作，每個標本設(shè)3個復孔。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS11.5軟件，計量資料以均值±標準差±s)表示。采用One Way-ANOVA方差分析，2組間比較采用Turkey法檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。數(shù)據(jù)間相關(guān)性用Pearson相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)（r值）為正，表示正相關(guān)，r值為負，表示負相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Th1/Th2亞群比例及比值 造模后第7 d，模型組Th1亞群比例、Th1/Th2比值顯著高于正常組（P＜0.05），Th2亞群比例顯著低于正常組（P＜0.05）。與正常組大鼠比較，單體中、小劑量組及模型組Th1亞群比例、Th1/Th2比值顯著升高（P＜0.05），Th2亞群比例顯著降低（P＜0.05）。單體大劑量組Th1亞群比例、Th2亞群比例以及Th1/Th2比值，與假手術(shù)組與正常組比較，無顯著性差異（P＞0.05）。與綠原酸中、小劑量組比較，綠原酸大劑量組Th1亞群比例顯著降低，Th2亞群比例顯著升高，Th1/Th2比值明顯降低（P＜0.05）。提示Th1/Th2亞群偏移參與了大鼠DVT形成，綠原酸對DVT大鼠Th1/Th2亞群分化狀態(tài)具有調(diào)節(jié)作用，能優(yōu)勢誘導Th2亞群偏移，逆轉(zhuǎn)DVT大鼠Th1/Th2亞群失衡狀態(tài)，其作用呈劑量依賴性。詳見表1。

表1 各組大鼠Th1/Th2亞群比例及比值（%，±s）

表1 各組大鼠Th1/Th2亞群比例及比值（%，±s）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與假手術(shù)組比較，bP＜0.05，與模型組比較，cP＜0.05，與單體小劑量組比較，dP＜0.05，與單體中劑量組比較，eP＜0.05

組別n單體大劑量組單體中劑量組單體小劑量組模型組假手術(shù)組正常組10 10 10 10 10 10 Th1亞群(CD+TNF-α+) 14.38±0.41c、d、e 17.84±0.78a、b、c、d 20.36±0.73a、b、c、e 22.71±0.87a、b、d、e 14.37±0.53c、d、e 14.21±0.61c、d、e Th2亞群(CD+IL-4+) 4.91±0.14c、d、e 3.65±0.16a、b、c、d 3.24±0.14a、b、c、e 3.06±0.15a、b、d、e 4.88±0.30c、d、e 5.00±0.22c、d、e Th1/Th2 3.02±0.26c、d、e 4.85±0.32a、b、c、d 6.54±0.40a、b、c、e 7.20±0.45a、b、d、e 3.06±0.22c、d、e 2.92±0.15c、d、e

2.2 血清IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10水平 造模后第7 d，模型組大鼠IL-2、TNF-α水平顯著高于正常組（P＜0.05），IL-4、IL-10水平顯著低于正常組（P＜ 0.05）。與正常組大鼠比較，單體中、小劑量組及模型組大鼠IL-2、TNF-α水平顯著升高（P＜0.05），IL-4、IL-10水平顯著降低（P＜0.05）。單體大劑量組IL-2、TN-α水平與與假手術(shù)組與正常組大鼠比較，無顯著性差異（P＞0.05），IL-4、IL-10水平與假手術(shù)組與正常組大鼠比較，無顯著性差異（P＞0.05）。單體大劑量組IL-2、TNF-α水平顯著低于中、小劑量組（P＜0.05），IL-4、IL-10水平顯著高于中、小劑量組（P＜0.05）。提示Th1型細胞因子IL-2、TNF-α蛋白表達升高及Th2型細胞因子IL-4、IL-10蛋白表達降低參與了DVT的形成過程，綠原酸通過調(diào)節(jié)Th1/Th2亞群比例，降低Th1型細胞因子表達，增加Th2型細胞因子表達，對其特征性細胞因子的調(diào)節(jié)作用呈明顯劑量依賴性，證實其通過對Th1/Th2亞群分化調(diào)節(jié)作用進而減輕炎性細胞因子介導的炎癥反應，保護血管內(nèi)皮，治療DVT。詳見表2。

表2 各組大鼠血清IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10水平（±s，pg/mL）

表2 各組大鼠血清IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10水平（±s，pg/mL）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與假手術(shù)組比較，bP＜0.05；與模型組比較，cP＜0.05；與單體小劑量組比較，dP＜0.05；與單體中劑量組比較，eP＜0.05；與單體大劑量組比較，fP＜0.05

組別單體大劑量組單體中劑量組單體小劑量組模型組假手術(shù)組正常組n 10 10 10 10 10 10 IL-2 50.22±4.06c、d、e57.70±3.53a、c、d、f 65.45±6.28a、b、e、f 72.10±7.48a、b、e、f 51.42±4.50c、d50.65±3.40c、d、e TNF-α 110.22±10.32c、d、e128.52±13.17a、b、c、d、f 156.45±13.00a、b、c、e、f 173.50±17.02a、b、d、e、f 110.70±9.43c、d、e 109.33±9.29c、d、e IL-4 418.72±15.32c、d、e398.24±16.82a、b、c、d、f 375.40±11.24a、b、c、e、f 347.46±11.24a、b、d、e、f 418.55±13.78c、d、e 427.32±12.10c、d、e IL-10 39.32±2.83c、d、e35.86±2.74a、b、c、d、f 32.30±2.41a、b、c、e、f 28.55±1.78a、b、d、e、f 38.21±3.08c、d、e 38.74±2.54c、d、e

2.3 Th1/Th2比例與血清炎癥標記物相關(guān)性分析經(jīng)過相關(guān)性分析，Th1/Th2比例與IL-2、TNF-α呈正相關(guān)（P＜0.05），與IL-4、IL-10呈負相關(guān)（P＜0.05）。詳見表3。

表3 大鼠Th1/Th2亞群比例與血清炎癥標記物相關(guān)性分析

3 討論

DVT是臨床常見的周圍血管疾病，早期易并發(fā)致命性肺栓塞，后期因靜脈瓣膜破壞，患肢出現(xiàn)腫脹、色素沉著、濕疹樣皮炎、慢性潰瘍等DVT后綜合癥，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。T細胞是機體免疫調(diào)節(jié)的主體細胞，在抵御外界病原體感染及維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用。初始T細胞受抗原刺激后，在分化誘導因子及特異性核轉(zhuǎn)錄因子作用下分化為不同的亞群，產(chǎn)生特異性細胞因子，主導不同的免疫反應。CD4+T細胞經(jīng)IFN-γ和IL-12誘導分化為Th1亞群，分泌IL-2、TNF-α等細胞因子，介導細胞免疫。初始T細胞經(jīng)IL-4誘導分化成Th2亞群，分泌IL-4、IL-10等細胞因子，激活B細胞，介導體液免疫，能拮抗性抑制Th1型細胞因子介導的炎癥反應，使機體的免疫應答限制在適度范圍，避免過強的炎癥反應導致的組織損傷。Th1/Th2亞群相互調(diào)節(jié)，處于動態(tài)平衡之中，維持機體正常免疫功能及自穩(wěn)狀態(tài)[7-8]。

IL-2通過誘導T-bet的表達和上調(diào)IL-12Rβ2亞基促進Th1細胞分化,同時它還刺激NK細胞、巨噬細胞的活化生長和增強它們的殺傷能力[9-10]。IL-4是通過激活STAT6途徑，依靠轉(zhuǎn)錄因子GATA-3等因素確保CD4+T細胞向Th2細胞分化[11]。IL-4可抑制單核巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β和TNF-α，下調(diào)活化的單核巨噬細胞分泌氧自由基，還能抑制前列腺素E2和IL-8產(chǎn)生，誘導IL-1RA產(chǎn)生，提高IL-1RA及IL-1β比例從而起到一定的抑炎作用。IL-10是Th1細胞分化的下調(diào)者，由Th2細胞分泌，主要抑制激活的單核細胞、巨噬細胞、粒細胞和T細胞，還能有效地在mRNA水平抑制單核細胞產(chǎn)生IL-1β，TNF-α，IL-6和IL-8等促炎癥因子和趨化因子[12-13]。

在類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)關(guān)節(jié)滑液中，Th1亞群占絕對優(yōu)勢，Th1/Th2明顯失衡，Th1、Th2細胞及其分泌的細胞因子平衡狀態(tài)的紊亂是造成RA的主要原因[14-15]。在對橋本甲狀腺炎（hashimoto thyroiditis，HT）患者的研究中發(fā)現(xiàn)，其甲狀腺組織內(nèi)浸潤的輔助性T細胞主要為Th1細胞，表現(xiàn)為Th1細胞因子亢進占優(yōu)勢[16]。在犬自身免疫性甲狀腺炎模型血清中，Th1型細胞因子被檢測到高表達，而Th2型細胞因子IL-4的表達則降低[17]。有學者在感染后腸易激綜合征（postinfectious irritable boewlsyndrome，PI-IBS）研究中發(fā)現(xiàn)，不同中醫(yī)證型其Th1/Th2漂移程度不同，Th1亞群（INF-γ、IL-2）指標，肝氣郁滯證組＞肝郁脾虛證組＞脾胃虛弱證組；Th2（IL-4、IL-5）指標，脾胃虛弱證組＞肝郁脾虛證組＞肝氣郁滯證組。并認為，PI-IBS實證患者細胞免疫較強，Th1/Th2左偏；而虛證患者則偏向于體液免疫，Th1/Th2右偏[18]。

綠原酸是中藥茵陳的主要有效單體成分，大量的實驗證明綠原酸是一種自由基清除劑及抗氧化劑，它通過清除氧自由基及抗脂質(zhì)過氧化，可保護血管內(nèi)皮細胞，進而對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生有效的保護作用[19-20]。藥理研究證實，綠原酸對免疫功能具有調(diào)節(jié)作用，可以通過抑制炎癥反應，改善靜脈內(nèi)皮功能。本研究發(fā)現(xiàn)，在DVT模型大鼠Th1亞群比例明顯升高，Th2亞群比例明顯降低，Th1型細胞因子占主導地位，提示Th1/Th2亞群失衡參與了DVT形成過程。綠原酸治療后，DVT大鼠Th1亞群比例及炎性因子表達顯著降低，Th2亞群比例及抑炎因子表達顯著升高，證實綠原酸通過優(yōu)勢誘導Th2亞群分化，逆轉(zhuǎn)Th1/Th2亞群失衡，減少Th1型炎性細胞因子分泌，進而減輕炎癥反應對血管內(nèi)皮的損傷，治療DVT，綠原酸大劑量組療效優(yōu)于中、小劑量組。經(jīng)過相關(guān)性分析，我們觀察到Th1/Th2比例與IL-2、TNF-α呈正相關(guān)，與IL-4、IL-10呈負相關(guān)。通過本研究，未發(fā)現(xiàn)綠原酸有明顯毒副作用。

本研究證實，Th1/Th2亞群失衡參與了DVT形成過程，綠原酸通過逆轉(zhuǎn)Th1/Th2亞群失衡，減輕炎癥反應，進而保護血管內(nèi)皮細胞，發(fā)揮治療DVT的作用。但DVT中Th1/Th2亞群失衡的根源及綠原酸調(diào)節(jié)Th1/Th2亞群偏移的分子機制尚需進一步深入探討。

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（收稿：2014-02-10 修回：2014-10-12）

（責任編輯 王 豐）

Regulating Effect of Chlorogenic Acid on T cell Subsets Imbalance in Deep Venous Thrombosis of Rats

LIU Li-qing,WANG De-hua,WANG Bin,et al.
College of Life Science of Jinan University，Jinan Shandong (250014)，China

Objective To evaluate the role of Th1/Th2 shift in deep venous thrombosis(DVT)and elucidate the mechanism of chlorogenic acid in treating DVT in rat models.MethodForty DVT rats were divided randomly into DVT group and chlorogenic acid high dose,middle dose and low dose groups.Additionally,10 rats with sham operation were taken as sham operation group and 10 normal rats were taken as normal group respectively.Rats of chlorogenic acid group were treated with chlorogenic acid for 7 days,while rats of other groups were treated with physiological saline for the same duration.Then,the proportions of Th1(CD4+TNF-α+) subset and Th2(CD4+IL-4+)subset were detected by flowcytometry.Moreover,the protein expressions of IL-2, TNF-α,IL-4 and IL-10 in rat serum were analyzed by ELISA assay,and the proportion of Th1/Th2 correlated with serum levels of inflammatory markers was analyzed.ResultsCompared with normal and sham operation groups,the proportion of Th1 subset was increased while that of Th2 subset was decreased significantly in DVT group（22.71±0.87%,3.06±0.15%）.In addition,protein expression of IL-2 and TNF-αwas enhanced（72.10±7.48 173.50±17.02,pg/mL）while that of IL-4 and IL-10 was inhibited markedly in DVT rats（347.46±11.24 28.55±1.78,pg/mL）.After chlorogenic acid administration,the proportion of Th1 subset was down-regulated while that of Th2 subset was up-regulated significantly in DVT rats（14.38±0.4 14.91±0.14,%）.Moreover,the protein expression ofIL-2 and TNF-αdecreased while that of IL-4 and IL-10 increased obviously after chlorogenic acid administration,Th1/Th2 proportional positively correlated with IL-2 and TNF-α,and negatively correlated with IL-4, IL-10（50.22±4.06 110.22±10.32,418.72±15.32 9.32±2.83,pg/mL）.ConclusionTh1/Th2 shift is involved in DVT.Chlorogenic acid can down-regulate the Th1 subsets and up-regulate the Th2 subsets and exert the curative effect on DVT mice.

Chlorogenic acid;Th1/Th2 subsets;deep vein thrombosis;cytokines

Q95-33;R654.4

A

1007-6948(2014)06-0607-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2014.06.011

國家自然科學基金資助項目（81102600，81373670）;山東省優(yōu)秀青年科學家獎勵基金（BS2010-YY069）;山東省中醫(yī)藥發(fā)展計劃（2012GSF11840）;濟南市科技明星計劃項目（濟科合字2012）

1.山東省醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所（濟南 250062）

2.濟南大學醫(yī)學與生命科學院（濟南 250062）

3.山東省立醫(yī)院手足外科（濟南 250011）

4.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院周圍血管病科（濟南 250014）

5.濟南軍區(qū)總醫(yī)院放療科（濟南 250031）

田楠楠，E-mail：13589040205@139.com