膽囊結(jié)石患者主要感染病原菌譜分析

宗春輝，吳尚為，張　辰，李東華，劉洪斌

論著

膽囊結(jié)石患者主要感染病原菌譜分析

宗春輝1，吳尚為1，張辰2，李東華1，劉洪斌3

目的：研究膽囊結(jié)石主要感染病原菌的分布及特征。方法：對(duì)膽囊結(jié)石60例，非膽囊結(jié)石66例患者手術(shù)切除的膽囊、結(jié)石和膽汁樣本分別行細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)，對(duì)主要檢出菌做脈沖場凝膠電泳，分析菌株同源性。結(jié)果：126例患者共檢出88株病原菌，排在前3位的是銅綠假單胞菌，肺炎克雷白桿菌和大腸桿菌，其中銅綠假單胞菌和肺炎克雷白桿菌在結(jié)石組和非結(jié)石組的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)脈沖場凝膠電泳它們分屬不同的型別。結(jié)論：膽囊結(jié)石患者感染病原菌以革蘭陰性菌為主，細(xì)菌感染可能參與了膽囊結(jié)石的形成。

膽囊結(jié)石；細(xì)菌感染；分子流行病學(xué)；脈沖場凝膠電泳

當(dāng)膽汁排出受阻時(shí)，腸道內(nèi)的細(xì)菌便經(jīng)血液、淋巴液或逆行進(jìn)入膽道及膽囊引發(fā)急慢性膽囊炎，并可能成為誘發(fā)膽囊結(jié)石的始動(dòng)因子。我們對(duì)2011年10月—2012年12月126例經(jīng)腹腔鏡手術(shù)切除的膽囊、結(jié)石和膽汁行細(xì)菌學(xué)需氧、厭氧培養(yǎng)，并對(duì)主要檢出菌株行脈沖場凝膠電泳分析，排除院內(nèi)感染，以期明確細(xì)菌感染與膽囊結(jié)石形成的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1臨床資料全組共126例，其中膽囊結(jié)石60例，年齡為23～69歲，平均45歲；男32例，女28例；非膽囊結(jié)石66例（膽囊息肉36例，慢性膽囊炎30例未合并膽囊結(jié)石），年齡為30～72歲，平均49歲；男30例，女36例；術(shù)前均未預(yù)防性使用抗生素，全麻下腹腔鏡膽囊切除術(shù)后，無菌注射器抽取膽汁5 mL，剪取膽囊黏膜約1.5 cm×1.5 cm置于無菌試管中。膽石組同時(shí)收集膽囊結(jié)石,測(cè)量并記錄其大小、數(shù)目,用生理鹽水沖洗干凈。標(biāo)本放于50mL無菌EP管，即刻接種到細(xì)菌培養(yǎng)基。該項(xiàng)目已通過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并簽署知情同意書。

1.2試劑和儀器BAP培養(yǎng)基、MAC培養(yǎng)基購自天津金章公司；LB Broth粉末購于MDBio，Inc公司；厭氧菌培養(yǎng)袋（法國bioMé rieux公司，批號(hào)1001017300）；限制性內(nèi)切酶Spe I、Xba I和λLadder PFGE Marker為New England Biolabs公司產(chǎn)品；溶菌酶，蛋白酶K購自Invitrogen公司；RNase A為Sigma產(chǎn)品；低熔點(diǎn)瓊脂糖，PFGE電泳專用瓊脂糖均為Bio-Rad公司產(chǎn)品；Microstation快速微生物鑒定系統(tǒng)(美國Biolog公司)；蛋白核酸測(cè)定儀購自Eppendorf AG公司；CHEF MAPPERTM型電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)購于Bio-Rad公司。

1.3鑒定用Microstation快速微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，質(zhì)量控制菌株大腸桿菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌菌ATCC 27853、金黃色葡萄球菌ATCC 25923均購自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.4細(xì)菌培養(yǎng)需氧菌培養(yǎng)：將膽汁用細(xì)菌螺旋接種儀接種于BAP培養(yǎng)基和MAC培養(yǎng)基；膽囊組織內(nèi)膜經(jīng)生理鹽水洗滌后碾碎，加生理鹽水1mL混勻后靜置，取上清液用一次性接種環(huán)涂于BAP培養(yǎng)基和MAC培養(yǎng)基；結(jié)石經(jīng)生理鹽水洗滌后無菌刀片切開，取核心成分碾碎，加生理鹽水1mL，混勻后靜置5 min，取上清液涂于BAP培養(yǎng)基和MAC培養(yǎng)基，以上均放于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。厭氧菌培養(yǎng)：將膽汁、經(jīng)生理鹽水洗滌后的膽囊組織內(nèi)膜分別接種到厭氧培養(yǎng)皿上（CDC-普通厭氧菌培養(yǎng)皿），放置于厭氧培養(yǎng)袋中，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48～72 h。

1.5脈沖場凝膠電泳挑取LB固體培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng)的5～6個(gè)菌落轉(zhuǎn)種于20 mL LB肉湯培養(yǎng)液中，37℃水浴搖床過夜。取500μL菌液于1.5 mL離心管中，13 000 r/min離心2 min。棄上清首先加入500μL PIV，13 000 r/min離心2min，棄上清加入200μL PIV，充分混勻后測(cè)定OD600光密度，用公式（40×OD600×210）-210計(jì)算出所需PIV量，依次加入1.5 mL離心管中與原菌液混勻。取150μL菌液42℃水浴10min，1.5%低熔點(diǎn)膠42℃水浴，并將兩者等體積充分混勻入模具，-20℃5min，室溫10min，將膠塊切成2～3 mm的小塊。將小膠塊放入1 mL EC溶菌液中，完全浸沒，37℃水浴至少4 h。吸出EC溶菌液加1 mL ES溶液50℃搖床輕搖30 min；吸出ES溶液，加入1 mL ESP溶液50℃消化至少20 h；10 mL TE搖床輕搖30 min，重復(fù)5次。將小膠塊浸入50 uL的酶切體系（銅綠假單胞菌用約含20 U SpeI酶、肺炎克雷白桿菌用20 U Xba I酶）37℃酶切過夜。制1%PFGE專用凝膠，然后將0.5×TBE洗滌后的酶切膠塊15 min，與λLadder Marker同時(shí)放入加樣孔中，用0.75%的低熔點(diǎn)膠封閉加樣孔。電泳條件：溫度14℃，電壓6 V/cm,角度60°/-60°，電泳時(shí)間20 h，脈沖參數(shù)：5～15 s，10 h；15～45 s，10 h，線性條件。取10 uL EB染色劑加入200 mL蒸餾水中，混勻后將電泳后凝膠輕輕放入其中，避光輕搖20min，用Gel Doe凝膠成像系統(tǒng)掃描成像儀讀膠并應(yīng)用Quantity One軟件分析圖像。PFGE圖譜按Tenover[1]的分型標(biāo)準(zhǔn)與UPGMA方法（BioRad Quantity One軟件）結(jié)合進(jìn)行基因分型。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù),率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1病原菌兩組126例患者共獲取標(biāo)本272例（包括膽囊126例，膽汁90例，結(jié)石56例），88例標(biāo)本需氧培養(yǎng)陽性，陽性率32.4%。其中膽囊檢出病原菌53株（42.1%），膽汁檢出菌31株（34.4%），膽結(jié)石檢出菌4株（0.7%）。兩組患者共檢出88株菌，革蘭陰性菌86株（97.7%），前3位為銅綠假單胞菌、肺炎克雷白桿菌、大腸桿菌；革蘭陽性菌2株（2.3%），為屎腸球菌；未發(fā)現(xiàn)厭氧菌(見表1)。

表1　病原菌檢出情況

2.2主要檢出菌前3位菌株在結(jié)石組和非結(jié)石組的分布如表2所示。不同菌株在兩組的檢出率進(jìn)行比較，銅綠假單胞菌、肺炎克雷白桿菌在結(jié)石組培養(yǎng)陽性率比非結(jié)石組高（P＜0.05）。在前3位主要檢出菌中，膽囊來源的銅綠假單胞菌、肺炎克雷白桿菌、大腸桿菌在結(jié)石組分別檢測(cè)到12株、14株、6株，共32株，在非結(jié)石組分別為2株、4株、4株，共10株；膽汁來源的銅綠假單胞菌、大腸桿菌在結(jié)石組分別檢測(cè)到6株、2株，共8株，在非結(jié)石組為2株、2株，共4株。

2.3銅綠假單胞菌PFGE分型22株銅綠假單胞菌經(jīng)PFGE分型分為18個(gè)型別，即A-R，其中A型2株，C型2株，F(xiàn)型2株，L型2株（見圖1）。

表2　結(jié)石組和非結(jié)石組的主要檢出菌

圖1　銅綠假單胞菌PFGE分型

2.4肺炎克雷白桿菌菌PFGE分型20株被分為17個(gè)型別，即A-Q，其中B型2株，E型2株，P型2株（見圖2）。

圖2　肺炎克雷白桿菌菌PFGE分型

3　討論

膽道感染菌株中以革蘭陰性菌為主[2]。本文結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌感染有22株占25%，居感染菌的第1位，肺炎克雷白桿菌20株（22.7%）、大腸桿菌16株（18.2%），分別占第2位和第3位。這可能與近年來抗菌藥物種類迅速增加及廣譜抗生素尤其是頭孢菌素的廣泛應(yīng)用有關(guān)。

本研究膽汁檢出菌31株（34.4%），與以往報(bào)道的34.57%相似[3]，且以革蘭陰性菌為主，主要包括銅綠假單胞菌菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌等。膽囊黏膜檢出菌53株（42.1%），低于以往報(bào)道的64%[4]。膽囊黏膜和膽汁細(xì)菌檢出率高于膽結(jié)石，可能由于膽汁和膽囊黏膜檢出菌反應(yīng)的是膽囊切除手術(shù)時(shí)膽道當(dāng)時(shí)的細(xì)菌感染情況，而結(jié)石形成需要一個(gè)較長的過程，包埋其中的細(xì)菌或許早已死亡，所以術(shù)中取出的結(jié)石常常檢測(cè)不到活菌株。近年越來越多的研究發(fā)現(xiàn),膽道感染與膽囊結(jié)石常為因果關(guān)系。1995年，Swidsinski從20例膽固醇結(jié)石中擴(kuò)增到細(xì)菌DNA片段,經(jīng)膽石測(cè)序大腸桿菌、梭狀芽孢桿菌和痤瘡丙酸桿菌分別占25%、35%、45%,使得曾被忽視的細(xì)菌在膽固醇結(jié)石形成中作用的研究有了新的進(jìn)展。

以往文獻(xiàn)報(bào)道，膽道感染中厭氧菌陽性率的高低差異很大,從24%到50%不等，且厭氧菌并不單獨(dú)引起膽道感染，而是與需氧菌共同存在，導(dǎo)致混合感染。本組病例厭氧菌檢出率為0，這除與厭氧菌培養(yǎng)條件高難于檢出，膽汁在抽取、運(yùn)送等過程中厭氧環(huán)境可能被破壞等有關(guān)外，還需提高厭氧菌檢測(cè)技術(shù)。近年來有報(bào)道稱，革蘭陰性菌的檢出率有逐漸降低而革蘭陽性菌檢出率有逐漸升高的趨勢(shì)[5]，但目前革蘭陰性菌感染仍占有重要地位。在醫(yī)院臨床分離的革蘭陰性菌中，銅綠假單孢菌和肺炎克雷白桿菌仍占較高比例，它們是臨床分離的主要條件致病菌，也是引起醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌。

在病原菌流行病學(xué)調(diào)查研究中，病原菌基因分型已被公認(rèn)為是能夠提供病原菌菌株間同源相關(guān)性研究的主要依據(jù)。其中脈沖場凝膠電泳(pulsed-dield gel electrophoresis，PFGE)是公認(rèn)的對(duì)菌株進(jìn)行分子流行病學(xué)分析的金標(biāo)準(zhǔn)。通過分子分型可以鑒定比較菌株是否一致，對(duì)于細(xì)菌性傳染病監(jiān)測(cè)、傳染源追蹤、傳播途徑調(diào)查和識(shí)別等流行病學(xué)調(diào)查有非常重要的意義。本研究結(jié)果顯示銅綠假單胞菌和肺炎克雷白桿菌在結(jié)石組和非結(jié)石組中的檢出率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示它們可能參與了結(jié)石的形成。由于肺炎克雷白桿菌和銅綠假單胞菌是院內(nèi)感染的常見菌株，為了明確這兩種菌是否是患者的自身感染菌株并參與了結(jié)石的形成，本研究用PFGE對(duì)此兩種菌株進(jìn)行了分型，結(jié)果顯示，這兩種菌均為散發(fā)感染，即是患者自身攜帶菌株。Chuang等[6]的研究表明，膽囊黏膜在感染條件下產(chǎn)生的黏蛋白可相互聚集形成膠樣或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),成為膽固醇結(jié)石和膽色素鈣鹽沉積的骨架。國內(nèi)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[7]，克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌的內(nèi)毒素使培養(yǎng)的大鼠膽囊上皮細(xì)胞糖蛋白分泌增加,尤以大腸桿菌的作用最強(qiáng)。Koppisetti等[8]發(fā)現(xiàn)，感染的膽囊壁及膽汁中氧自由基水平顯著升高，刺激膽囊黏膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生并釋放大量黏蛋白。因此,細(xì)菌可能在啟動(dòng)成核、破壞膽囊功能、促進(jìn)膽固醇和鈣鹽沉積等諸多環(huán)節(jié)促進(jìn)結(jié)石形成。

本研究結(jié)果提示，細(xì)菌感染可能參與了膽結(jié)石的形成。因此，在臨床工作中對(duì)各種細(xì)菌感染引起的膽道疾病要給予足夠重視,對(duì)感染細(xì)菌及早做出診斷,并應(yīng)用有效藥物進(jìn)行合理徹底的治療,以期能阻止膽囊結(jié)石的發(fā)生或延緩其形成過程。

[1]Tenover FC,Arbeit RD,Goering RV,et al.Interpreting chromosomal DNA restrict ion patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis：criteria for bacterial strain typing[J].J Clin Microbiol, 1995,33(9)：2233-2239.

[2]王金鳳，常璠.某院普外科膽道細(xì)菌感染及耐藥性分析[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013,34（3）：322-324.

[3]楊亞敏,闞志超,張富玉,等.膽道感染患者膽汁病原菌培養(yǎng)及藥敏分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010,20（21）：3427-3429.

[4]陳廣平，朱雷明，蔡端.膽固醇結(jié)石患者膽囊細(xì)菌感染的研究[J].肝膽胰外科雜志，2007,19（3）：31-33.

[5]Curtis C，Shetty N.Recent trends and prevention of infection in the neonatal intensive care unit[J].Curr Opin Infect Dis，2008，21 (4)：350-356．

[6]Chuang SC,Hsi E,Lee KT.Mucin genes in gallstone disease[J]．Clin Chim Acta,2012,413(19-20)：1466-1471.

[7]王學(xué)軍，李玉民，李世雄.細(xì)菌在膽固醇結(jié)石形成中的作用研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2003,13（3）：12-15.

[8]Koppisetti S,Jeniqiri B,Terron MP et al.Reactive oxygen species and the hypomotility of the gall bladder as targets for the treatment of gallstones with melatonin：a review.Dig Dis Sci,2008,53(10)：2592-2603.

（收稿：2013-10-20修回：2014-08-06）

（責(zé)任編輯張淑坤）

Analysis of Microbial Spectrum in Patients with Cholecystolithiasis

ZONG Chun-hui，WU Shang-wei, ZHANG Chen,et al.
Department of Pharmacology,Institute of Acute Abdominal Diseases of Tianjin,Tianjin (300100),China

ObjectiveTo study the distribution and characteristics of main pathogens in specimen of gallbladder stones.MethodsGallbladders,gallstones and bile collected from cholecystectomy were cultured,including 60 patients with cholecystolithiasis and 66 controlled patients without cholecystolithiasis.The homology of the main bacteria isolates was analyzed by pulsed field gel electrophoresis to exclude the hospital infection.ResultsEighty-eight bacteria strains were cultured from 126 patients and the top three strains were Pseudomonas aeruginosa,Klebsiella pneumonia and Escherichia coli.The positive rates of Pseudomonas aeruginosa and Klebsiella pneumonia in gallstone group were significently higher than that in non gallstone group.The bacteria types were also different as shown by pulsed field gel electrophoresis in two groups.ConclusionThe gram negative bacteria are the main pathogens in patients with gallbladder stones.Bacterial infections may involve in the formation of gallstones.

Cholecystolithiasis;bacterial infection;molecular epidemiology;pulsed field gel electrophoresis

R657.4+2；R37

A

1007-6948(2014)05-0467-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2014.05.001

1.天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所藥理室（天津 300100）

2.天津市南開醫(yī)院微創(chuàng)外科中心（天津 300100）

3.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所（天津 300070）

吳尚為，E-mail：shangwei10021@yahoo.com