系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血miR-7的表達(dá)及其意義

李 揚(yáng)，沈 濂，葉燕霞，張 烜*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院血液科，北京100050;1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，北京100730;3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京100005)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種多系統(tǒng)受累的自身免疫性疾病，B細(xì)胞的異常增殖活化是SLE 的特征之一［1］。小RNA(microRNAs，miRNAs)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類單鏈非編碼小RNA，成熟miRNA 能夠在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶mRNA 表達(dá)［2］。近年多項(xiàng)研究證明，miRNAs 參與生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老、凋亡的調(diào)控及遺傳背景的穩(wěn)定，并與人類疾病相關(guān)［3］。miR-7 與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4－8］，然而miR-7 在自身免疫病特別是SLE 的發(fā)病中的作用尚無(wú)研究。本研究旨在探索miR-7 在SLE 患者中的表達(dá)及功能。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

北京協(xié)和醫(yī)院2009 至2010年門診初治SLE 患者20 例，均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1997年修訂的SLE 診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除患有其他全身性疾病者。正常對(duì)照20 例來(lái)自健康志愿者，年齡、性別與病例匹配，同時(shí)不得具備SLE 診斷標(biāo)準(zhǔn)中的任何一條。經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，納入研究前患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑

淋巴細(xì)胞分離液(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);流式熒光抗體PE-CD3，F(xiàn)ITC-CD19，APCCD14;Trizol 和Cell TraceTMCFSE 增值檢測(cè)試劑(Invitrogen 公司);RNA 提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天寶生物工程有限公司);miR-7 表達(dá)檢測(cè)試劑盒(ABI 公司);miR-7 前體Pre-miRTM-miR-7 前體及陰性對(duì)照Pre-miRTMmiRNA 前體-陰性對(duì)照，miR-7 抑制劑anti-miRTM-miR-7 抑制劑及陰性對(duì)照anti-miRTMmiRNA 抑制劑-陰性對(duì)照(Ambion 公司);B 細(xì)胞電轉(zhuǎn)試劑盒(Amaxa 公司)。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的分離及T、B 細(xì)胞及單核細(xì)胞的分選

將PBS 稀釋后的外周血細(xì)胞懸液貼壁緩慢的加入預(yù)置淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，2 000 r/min室溫離心20 min，吸取白膜層細(xì)胞即PBMC，PBS 洗滌2 次，加入熒光抗體PE-CD3、FITC-CD19 和APCCD14，4 ℃避光孵育20 min，0.5%牛血清白蛋白的PBS 洗滌2 遍，通過(guò)流式細(xì)胞儀分選T、B 細(xì)胞及單核細(xì)胞。

1.4 熒光定量PCR

提取20 例SLE 患者及20 例HC 的PBMC、T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和單核細(xì)胞中的總RNA(包括microRNA)，1.2%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀，檢測(cè)總RNA 的質(zhì)量和濃度。采用TaqMan 試劑盒檢測(cè)miR-7 的表達(dá)，采用2－△△Ct法計(jì)算樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)量。PCR 反應(yīng)體系為20 μL，其中包含TaqMan MicroRNA Assay(×20)探針1 μL，2 ×Taq-Man 通用PCR 預(yù)混液(Universal PCR Master Mix)10 μL，去核酸酶水7．67 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.33 μL。反應(yīng)條件為95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本3 個(gè)復(fù)孔。引物設(shè)計(jì)如下:PTEN上游引物:5'-CCAGGACCAGAGGAAACC-3'，下游引物:5'-GCTAGCCTTCTGGATTTGA-3'。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證預(yù)測(cè)的miR-7的靶基因

將miR-7 前體或?qū)φ张c含有預(yù)測(cè)靶基因PTEN 3'UTR 區(qū)的報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293T 細(xì)胞中，以預(yù)測(cè)的非靶基因IL-10 作為該系統(tǒng)的陰性對(duì)照，設(shè)計(jì)與miR-7 前體序列完全互補(bǔ)的序列作為該系統(tǒng)的陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定細(xì)胞熒光素酶活性。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)2次，每次3 個(gè)復(fù)孔。

1.6 細(xì)胞增殖的檢測(cè)

分選B 細(xì)胞后分4 組，分別轉(zhuǎn)染miR-7 前體及前體陰性對(duì)照、miR-7 抑制劑及抑制劑陰性對(duì)照，染色羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl Ester，CFSE)后，4組細(xì)胞均培養(yǎng)于RPMI 1640 完全培養(yǎng)基中，給予CD40L (20 μg/L)、anti-IgM (10 mg/L)、CpG(2.5 mg/L)刺激培養(yǎng)，5 d 后收取細(xì)胞上流式機(jī)檢測(cè)CFSE。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。經(jīng)過(guò)Kolmogorov-Smirnov 和Shapira-Wilk 檢驗(yàn)為正態(tài)性分布、方差一致的數(shù)據(jù)用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 SLE 患者miR-7 的表達(dá)上調(diào)

初治SLE 患者和HC 各8 例，SLE 患者PBMC中miR-7 的表達(dá)為0.86 ±0.03，顯著高于HC 的0.10 ±0.08，(P＜0.01)，流式細(xì)胞儀分選SLE 患者及HC 各12 例的T、B 細(xì)胞及單核細(xì)胞，SLE 患者B細(xì)胞中miR-7 的表達(dá)為0.59 ±0.08，顯著高于HC的0.31 ±0.06(P＜0.05)，然而SLE 患者T 細(xì)胞及單核細(xì)胞中miR-7 的表達(dá)與HC 無(wú)差異，分別為0.91 ± 0.18 和0.99 ± 0.18，及1.30 ± 0.36 和0.98 ±0.02.

2.2 PTEN 是miR-7 的靶基因

通過(guò)Targetscan、PicTar 及miRanda3 個(gè)軟件均預(yù)測(cè)到PTEN 的3'UTR 區(qū)存在miR-7 的結(jié)合位點(diǎn)(圖1A)，采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)的miR-7 能夠通過(guò)與互補(bǔ)序列結(jié)合有效抑制熒光素酶活性，說(shuō)明miR-7 可以通過(guò)與PTEN 的3'UTR 區(qū)相互作用發(fā)揮功能(圖1B)。在SLE 患者B 細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)或抑制表達(dá)miR-7 后，PTEN 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量相應(yīng)為0.82 ±0.18 及1.84 ±0.54(P＜0.05)，，說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-7 能夠在一定程度抑制PTEN 的基因表達(dá)，而抑制miR-7 能夠促進(jìn)PTEN 的基因表達(dá)(圖1C).因此gPTENg 是miR-7 的直接靶基因。

圖1 PTEN 是miR-7 的直接功能靶基因Fig 1 PTEN is a direct target of miR-7

2.3 SLE 患者B 細(xì)胞中PTEN mRNA 水平較HC下調(diào)

20 例初治SLE 患者B 細(xì)胞中PTEN mRNA 為0.92 ± 0.24，顯著低于20 例 HC 的 2.20 ±0.49 (P＜0.05)。

2.4 miR-7 能夠促進(jìn)B 細(xì)胞的增殖

在SLE 患者B 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-7 后，B 細(xì)胞增殖能力為35.12% ±8.16%高于miR-7 被抑制的B 細(xì)胞23.55% ±6.92%(P＜0.05)，說(shuō)明miR-7 能夠促進(jìn)B 細(xì)胞的增殖(圖2)。

3 討論

SLE 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，B 細(xì)胞異常增殖活化在其發(fā)病機(jī)制中占有重要地位，B 細(xì)胞通過(guò)分泌自身抗體，攝取和提呈自身抗原參與自身免疫現(xiàn)象的啟動(dòng)和維持。已有研究發(fā)現(xiàn)miRNA 參與多種自身免疫病的發(fā)生［9］。

本研究證實(shí)SLE 患者B 細(xì)胞中miR-7 的表達(dá)顯著高于HC，通過(guò)microRNA 靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-7 可能的靶基因，挑選了與SLE 密切相關(guān)的基因PTEN 進(jìn)行進(jìn)一步研究。

PTEN 是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具磷酸酶活性的抑癌基因，負(fù)調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號(hào)通路。在骨髓發(fā)育的未成熟B 細(xì)胞，PTEN 失活會(huì)使PI3K/AKT持續(xù)性激活，影響自身反應(yīng)性B 細(xì)胞的清除和中樞免疫耐受的形成［10］。PTEN 缺失易發(fā)生自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞增多、B 細(xì)胞類別轉(zhuǎn)換缺陷、活化誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶缺陷，導(dǎo)致外周血B 細(xì)胞數(shù)量的上升及抗凋亡能力上升［11］。本研究發(fā)現(xiàn)SLE 患者外周血B 細(xì)胞中miR-7 的表達(dá)較健康對(duì)照上調(diào)，PTEN mRNA的表達(dá)較健康對(duì)照減少，為了明確SLE 患者PTEN 的下調(diào)是否與miR-7 的上調(diào)有關(guān)，采取多種方法進(jìn)行驗(yàn)證。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)方法及雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證方法均支持PTEN 是miR-7 的靶基因，并且，通過(guò)體外轉(zhuǎn)染人的外周血B 細(xì)胞，使其過(guò)表達(dá)或者抑制表達(dá)miR-7 后，PTEN 的mRNA水平相應(yīng)下調(diào)或上調(diào)，進(jìn)一步證明miR-7 可直接負(fù)調(diào)控PTEN。在SLE 患者外周血B 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或者抑制表達(dá)miR-7，B 細(xì)胞增殖功能相應(yīng)增強(qiáng)或減弱，證明miR-7 能夠促進(jìn)B 細(xì)胞增殖。因此，SLE 患者B 細(xì)胞中上調(diào)的miR-7 可能通過(guò)下調(diào)PTEN 基因的表達(dá)而促進(jìn)B 細(xì)胞增殖，從而參與SLE 的發(fā)病。

圖2 miR-7 對(duì)B 細(xì)胞增殖的調(diào)控Fig 2 Modulation of B cells proliferation by miR-7

綜上所述，SLE 患者B 細(xì)胞中miR-7 上調(diào)可能是發(fā)病環(huán)節(jié)之一，miR-7 通過(guò)抑制PTEN 的表達(dá)而促進(jìn)B 細(xì)胞增殖。提示miR-7 可能是治療SLE 的潛在靶點(diǎn)之一。在今后的工作中，可以深入研究miR-7 是否通過(guò)PTEN/PI3K/Akt 通路參與SLE 患者B 細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞因子分泌等，明確該機(jī)制異常在SLE 發(fā)病中的作用。

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