OCT4異構(gòu)體在人胚胎干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)

傅 歆，孫雪健，曹 蕊，董 平，楊志崗，肖 苒

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院研究中心，北京100144)

OCT4 是含有POU 結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，有3 個(gè)異構(gòu)體:OCT4A，OCT4B 和OCT4B1［1］，在維持人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell，hESC)亞全能性和自我更新能力方面有重要作用［2－3］，mRNA 結(jié)合蛋白LIN28 和維持ESC 細(xì)胞干性的另外兩個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NANOG 和SOX2 對(duì)OCT4 的表達(dá)有調(diào)控作用。OCT4 異構(gòu)體是否參與維持人間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cell，hMSC)的多能性和自我更新能力缺乏研究。本實(shí)驗(yàn)比較了OCT4 異構(gòu)體及其調(diào)控因子在H9 hESCs、骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cell，BMSC)、脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose derived mesenchymal stem cell，ADSC)和皮膚成纖維細(xì)胞(skin fibroblast，F(xiàn)B)中的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和細(xì)胞

高糖DMEM、PBS 和雙抗(HyClone 公司);H9 hESC 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑(Gibco 和StemCell 公司);Matrigel(BD 公司);如無(wú)特殊說(shuō)明，化學(xué)藥品(Sigma公司);引物合成(北京賽百盛公司);RT-PCR 和real-time PCR 試劑(Invitrogen 和 Roche 公司);Western blot 所需試劑(北京優(yōu)博奧和Thermo Scientific 公司)。一抗 OCT4 (sc-8629)、LIN28 (sc-293120)、二抗(sc-2020 和sc-2301)(Santa Cruz 公司);一抗SOX2(ab75485)(Abcam 公司);一抗OCT4 (611020 )、SSEA-4 (560073 )、Tra-1-60(560071)、StemflowTM人MSC 分析試劑盒(BD 公司);一抗CD45、CD44、CD105、CD117、CD90、CD31、CD71 和NANOG(eBiosciences 公司);二抗(A21203和A11001)(Invitrogen 公司)。

H9 hESC(WiCell 公司)(同意書編號(hào):11-W0039)。ADSC 來(lái)源于接受抽脂術(shù)的健康人(青年女性)脂肪組織。BMSC 來(lái)源于健康志愿者(青年男性)髂骨骨髓。FB 來(lái)源于重瞼術(shù)切下的正常人皮膚組織(均知情同意)。

1.2 H9 hESC 的培養(yǎng)和分化潛能檢測(cè)

H9 hESC 在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)和Matrigel 上的培養(yǎng)及誘導(dǎo)其向成纖維細(xì)胞(H9 ebF)分化的方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［4］。將1 ×106～2 ×106H9 hESC 注射入聯(lián)合免疫缺失(severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠后腿肌肉，6 周后取材切片做HE 染色。

1.3 H9 hESC 免疫熒光染色

H9 hESC 甲醛固定后破膜液(0.2% Tween-20/PBS)37 ℃處理15 min，一抗OCT4(611010)、SSEA-4 和Tra-1-60 4 ℃過(guò)夜，二抗室溫避光3 h，Dapi 染細(xì)胞核1 min，熒光顯微鏡采集圖像。

1.4 hMSC 的定向誘導(dǎo)和鑒定

hMSC 成骨和成脂誘導(dǎo)方案及鑒定方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［5］。

1.5 RT-PCR 檢測(cè)

Trizol 裂解細(xì)胞提取總RNA，取1 μg 總RNA用于RT-PCR 和real-time PCR 檢測(cè)。引物序列見(jiàn)(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.6 Western blot 檢測(cè)OCT4 異構(gòu)體和LIN28 的蛋白表達(dá)

取H9 hESC，第4 代hMSC、FB 和第5、6 代H9-ebF，提取全細(xì)胞蛋白并測(cè)定濃度。文獻(xiàn)報(bào)道［6］的Western blot 方法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。

1.7 流式細(xì)胞分析MSC 表面標(biāo)志以及NANOG和SOX2 的表達(dá)

取第4 代hMSC，按eBiosciences 抗體或StemflowTM試劑盒說(shuō)明書標(biāo)記表面標(biāo)志物。取H9 hESC，第4 代hMSC、FB 和第6 代H9-ebF，破膜處理后孵育SOX2 一抗或NANOG-PE，PBS 沖洗后SOX2 標(biāo)記的樣本再孵育FITC 標(biāo)記二抗。以上樣本用FACSAriaTMⅡ流式細(xì)胞儀檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 H9 hESC 的培養(yǎng)及生物學(xué)特性鑒定

在MEF 及Matrigel 上，H9 hESC 的細(xì)胞克隆邊界光滑，結(jié)構(gòu)致密(圖1A);表達(dá)hESC 標(biāo)志基因:OCT4，NANOG，SOX2，不表達(dá)三胚層標(biāo)志基因:NeuroD1，Brachyury 和AFP(圖1B);高表達(dá)OCT4和hESC 表面標(biāo)志物SSEA-4，Tra-1-60(圖1C);H9 hESCs 注射入SCID 小鼠體內(nèi)可形成畸胎瘤，切片HE 染色可觀察到三胚層來(lái)源的結(jié)構(gòu)，如神經(jīng)玫瑰花環(huán)結(jié)構(gòu)(NR，外胚層)、平滑肌(SM，中胚層)、軟骨(Ca，中胚層)和管腔上皮(GE，內(nèi)胚層)(圖1D)。

2.2 hMSC 的表面抗原檢測(cè)及分化能力鑒定

ADSC 高表達(dá)hMSC 表面標(biāo)志物CD44、CD105、CD90(＞99%)，低表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD31、CD45、CD71 和CD117(＜0.5%)(圖2A)。BMSCs 高表達(dá)hMSC 表面標(biāo)志物CD105、CD90、CD73(＞90%)，低表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物Neg Cocktail，包括CD34、CD116、CD19、CD45 和HLA-DR(＜0.5%)(圖2B)。

ADSC 和BMSC 成骨誘導(dǎo)21 d 后茜素紅染色可見(jiàn)深紅色鈣化結(jié)節(jié)(圖2C);成脂誘導(dǎo)14d 后油紅O染色可見(jiàn)橘紅色脂滴(圖2D)。

2.3 OCT4 異構(gòu)體的mRNA 表達(dá)。

ADSC、BMSC 和FB 之間OCT4 異構(gòu)體的表達(dá)無(wú)差異，OCT4A 在H9 hESC 中的表達(dá)比在3 種細(xì)胞中高2000 倍以上，OCT4B 和OC4B1 的表達(dá)高10 倍以上(圖3A)。此外，4 種細(xì)胞中OCT4A 的表達(dá)均顯著高于OCT4B 和OCT4B1，而OCT4B 與OCT4B1的表達(dá)水平?jīng)]有差異(圖3B)。

圖1 H9 hESCs 的生物學(xué)特性檢測(cè)Fig 1 Characterizations of H9 hESCs

圖2 ADSC 和BMSC 生物學(xué)特性檢測(cè)Fig 2 Characterization of hMSC

圖3 OCT4 異構(gòu)體的mRNA 表達(dá)水平Fig 3 Expression of OCT4 isoforms mRNA(±s，n=3)

2.3 OCT4 調(diào)控因子的mRNA 表達(dá)

NANOG，SOX2 和LIN28 在H9 hESCs 中的表達(dá)顯著高于在hMSC 和FB 中(P＜0.01)，在FB 中的表達(dá)水平顯著高于在hMSC 中(P＜0.05)(圖4)。

2.4 OCT4 異構(gòu)體及其調(diào)控因子的蛋白表達(dá)

H9 hESC 除了表達(dá)OCT4A 蛋白(47 和45 ku)，還表達(dá)兩條大小為40 和28 ku 的蛋白條帶。已有研究報(bào)道，28 ku 條帶對(duì)應(yīng)OCT4B-265aa 蛋白，而40 ku條帶尚未明確;hMSC、H9-ebF 和FB 不表達(dá)任何OCT4 蛋白。此外，LIN28 蛋白也只在H9 hESC 中表達(dá)，在hMSC、H9 ebF 和FB 細(xì)胞中均不表達(dá)(圖5)。

H9 hESC 高表達(dá)NANOG(82.1%)和SOX2(97.6%)蛋白，而hMSC、H9 ebF 和FB 幾乎不表達(dá)NANOG(均＜1%)，F(xiàn)B 中有30.7%的細(xì)胞為SOX2表達(dá)陽(yáng)性，顯著高于ADSC (8.65%)和BMSC(6.56%)(圖6)。

3 討論

OCT4 前體mRNA 經(jīng)過(guò)選擇性剪切可形成3 個(gè)異構(gòu)體，OCT4A、OCT4B 和OCT4B1。OCT4A 異構(gòu)體經(jīng)翻譯形成OCT4A 蛋白，OCT4B 和OCT4B1 均能合成OCT4B-166aa，OCT4B-196aa 和OCT4B-265aa 3個(gè)蛋白［7］。OCT4A 是保持hESC 亞全能性的關(guān)鍵因子，而OCT4B 及OCT4B1 的作用尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，OCT4B 可能在細(xì)胞的應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮作用［8］，而OCT4B1 可能起著抑制細(xì)胞發(fā)生程序性凋亡的作用［9］。本研究比較了H9 hESC 與不同來(lái)源的hMSC 及FB 中OCT4 異構(gòu)體的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)hESC主要表達(dá)OCT4A 和少量OCT4B-256aa 蛋白;OCT4異構(gòu)體mRNA 在hMSC 及FB 中雖有低水平表達(dá)，但在蛋白水平均不表達(dá)。結(jié)果提示OCT4 表達(dá)水平的差異可能是hESC 和hMSC 在自我更新和分化潛能等方面存在差別的主要因素之一。

有研究證明，OCT4 與NANOG 和SOX2 組成互聯(lián)的自身調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)而調(diào)控自身編碼基因的轉(zhuǎn)錄［10］。本研究中，hMSC 與 FB 幾乎不表達(dá)NANOG，而低表達(dá)的SOX2 蛋白可能促進(jìn)了hMSC和FB 中OCT4 mRNA 的表達(dá)。此外，LIN28 對(duì)OCT4 的翻譯起調(diào)控作用，敲減LIN28 會(huì)降低OCT4 蛋白的表達(dá)［11］。本研究中，hMSC 和FB 不表達(dá)LIN28，進(jìn)一步解釋了OCT4 蛋白在hMSC 和FB 中表達(dá)的缺失。

OCT4 在細(xì)胞增殖、分化、應(yīng)激反應(yīng)和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，了解OCT4 異構(gòu)體在hESC 及hMSC 中的表達(dá)水平，有利于探索OCT4 在維持hESC 和hMSC 的生物學(xué)特性上可能發(fā)揮的作用及機(jī)制，為將來(lái)提高M(jìn)SC 的自我更新及分化能力，解決MSC 擴(kuò)增能力有限等方面提供思路。

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