敲減水通道蛋白1對(duì)小鼠雪旺細(xì)胞形態(tài)及水轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

章 杰，江 華，劉安堂，朱 鴷，張文俊，蘆立軒

(1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形美容科，江西南昌330006;2.第二軍醫(yī)大學(xué)上海長(zhǎng)征醫(yī)院整形外科，上海200003)

面神經(jīng)解剖特殊，損傷后受骨性面神經(jīng)管壓迫，常形成“水腫-缺血-水腫”的惡性循環(huán)，如何預(yù)防或減輕面神經(jīng)的水腫在面癱臨床治療中具有極其重要的意義。

水通道蛋白(AQPs)是存在于細(xì)胞膜上，介導(dǎo)不同類型細(xì)胞跨膜水轉(zhuǎn)運(yùn)的膜蛋白家族，與多種組織器官水腫形成和消除密切相關(guān)，在水液代謝的調(diào)節(jié)中起重要作用［1－3］。其中AQP1 是周圍神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)最多的水通道蛋白［4－7］。前期研究證實(shí)了面神經(jīng)組織內(nèi)存在AQP1 的表達(dá)，并在小鼠面神經(jīng)離斷傷模型中發(fā)現(xiàn)面神經(jīng)損傷后AQP1 表達(dá)增高，與面神經(jīng)損傷后水腫時(shí)相性變化高度一致，提示AQP1 與面神經(jīng)損傷后繼發(fā)性水腫密切相關(guān)，并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AQP1 定位在雪旺細(xì)胞上。但是AQP1 表達(dá)增高與面神經(jīng)水腫的因果關(guān)系還未確定，即AQP1 的高表達(dá)導(dǎo)致或加劇面神經(jīng)水腫?還是面神經(jīng)水腫伴行AQP1 的高表達(dá)尚無定論;且AQP1 在雪旺細(xì)胞內(nèi)如何發(fā)揮生理和病理作用也不清楚。因此，本研究應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNA 干擾技術(shù)下調(diào)雪旺細(xì)胞AQP1 表達(dá)，研究AQP1 表達(dá)抑制對(duì)雪旺細(xì)胞形態(tài)和水轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，進(jìn)而為研究AQP1 對(duì)面神經(jīng)損傷后水腫的基因治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)，C57BL/6 小鼠，雌雄不限，3 ～5 d［第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(滬)-2007-0005］。

1.2 材料

293 T 細(xì)胞、大腸桿菌DH5α 由第二軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物研究所保存提供;pLKO.1-TRC cloning vector Plasmid、psPAX2、pMD 質(zhì)粒(Addgene 公司);限制性內(nèi)切酶AgeⅠ、EcoRⅠ以及T4 DNA 連接酶(New England Biolabs 公司);質(zhì)粒抽提試劑盒(QIAGEN 公司);寡核苷酸在上海英駿(Invitrogen)生物技術(shù)有限公司合成;LipofectamineTM2000(Invitrogen 公司);2 ×Taq PCR MasterMix(含染料)(北京天根生物有限公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa 公司)，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master (Rox)(Roche 公司);Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡試劑盒(Biovision 公司);小鼠源AQP1 單克隆抗體(Santa Cruz 公司);小鼠源GAPDH單克隆抗體、山羊抗兔及山羊抗小鼠二抗均(Cell Signaling Technology 公司);［3H］-3-氧-甲基-D-葡萄糖(OMG)(Amersham 公司);根皮素(Sigma 公司)。

1.3 方法

1.3.1 小鼠雪旺細(xì)胞原代培養(yǎng):在解剖顯微鏡下于小鼠耳前與眼連線之間，用顯微鑷剝離皮膚及皮下組織顯露面神經(jīng)，可見面神經(jīng)主干及其分支，取出面神經(jīng)放入解剖液內(nèi)(以無機(jī)鹽和葡萄糖配成的PBS 緩沖液)，仔細(xì)剝除神經(jīng)外膜，顯微剪反復(fù)剪碎組織塊，0.25%胰蛋白酶37 ℃消化1 h，含10%胎牛血清的DF12 培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min離心5 min后培養(yǎng)基重懸，37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，以獲得雪旺細(xì)胞;24 h 后細(xì)胞貼壁，每隔1 天更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞80% ～90%匯合可傳代，每日倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀況。

1.3.2 免疫熒光共標(biāo)染色鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞AQP1 和S-100 表達(dá):應(yīng)用小鼠源AQP1 單克隆抗體和兔抗鼠S-100 抗體(雪旺細(xì)胞標(biāo)志物)對(duì)所培養(yǎng)原代雪旺細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光共標(biāo)染色，鑒定AQP1 的表達(dá)。具體操作步驟如下:取細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，密度適中的雪旺細(xì)胞爬片放入24 孔板內(nèi);4% 多聚甲醛固定15 min，浸入抗原修復(fù)液中(0.01 mol/L 檸檬酸鈉)，置92 ℃水浴鍋內(nèi)2 ～6 min;滴加AQP1 和S-100 一抗共25 μL(1∶50稀釋)，室溫下過夜;避光滴加二抗:山羊抗小鼠IgG-Cy3 和山羊抗兔IgG-FITC 各20 μL(1∶200稀釋)，室溫下靜置60 min;加入Hoechst 核抗體(1∶1 000)30 μL 染核，避光，室溫下靜置10 min;漂洗:0.01 mol/L PBS 洗5 min ×3 次;最后50%甘油PBS 封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。每個(gè)操作步驟前用0.01 mol/L PBS 漂洗3 次，每次5 min。

1.3.3 AQP1-shRNA 慢病毒載體感染雪旺細(xì)胞:小鼠AQP1-shRNA 慢病毒載體重組質(zhì)粒pLKOAQP1-SH 由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并鑒定，并已篩選有效shRNA 進(jìn)行慢病毒包裝［8］。接種目的細(xì)胞于6 cm 培養(yǎng)皿中，接種濃度1 ×105/mL，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到30% ～45%時(shí)，加入3mL 的病毒上清，同時(shí)加入2 mL含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入聚凝胺至終濃度4 ～8 mg/L 以提高病毒感染效率，24 h 后更換為正常培養(yǎng)基。48 h 使用3 mg/L 的PURO 進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)篩選，以正常細(xì)胞系作為對(duì)照，直至正常對(duì)照細(xì)胞全部死亡，得到慢病毒干擾AQP1 穩(wěn)定下調(diào)的細(xì)胞系。72 h 更換為正常培養(yǎng)基。

1.3.4 Real-time PCR 和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)受感染的雪旺細(xì)胞中AQP1 mRNA 和蛋白表達(dá):建好慢病毒穩(wěn)定感染的細(xì)胞系后收獲細(xì)胞，采用Trizol 試劑提取總RNA，使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行RNA 定量，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)AQP1 的表達(dá)，反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)變性2 min，以后每個(gè)循環(huán)條件為95 ℃，60 ℃1 min，循環(huán)40 次。引物:AQP1:正義鏈為5'-GGAGATGAAGCCCAAATAGAG-3'，反義鏈為5'-GCTCTGAGACCAGGAAACAGA-3';GAPDH 正義鏈為5'- GTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'，反義鏈為 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTA-3'。GAPDH 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)。用PBS 洗滌受感染和未感染的雪旺細(xì)胞，收集并用裂解液裂解，刮下裂解產(chǎn)物，4 ℃12 000 r/min(離心半徑r=8 cm)離心15 min，取上清;使用蛋白定量試劑盒測(cè)定裂解產(chǎn)物的蛋白濃度為2 g/L;用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉;加入一抗(小鼠源AQP1 單克隆抗體1∶1 000，小鼠源GAPDH單克隆抗體1∶5 000)，40 ℃過夜，TBST 洗膜3 次，每次10 min;加入1∶5 000稀釋的羊抗鼠IgG 二抗孵育PVDF 膜2 h，經(jīng)過多次清洗，用ECL-Plus 試劑盒觀察蛋白條帶。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。

1.3.5 倒置顯微鏡觀察AQP1-shRNA 感染雪旺細(xì)胞后形態(tài)變化:AQP1-shRNA 感染原代小鼠雪旺細(xì)胞后，與CTRL 組(scr-shRNA)比較，每隔24 h 觀察細(xì)胞形態(tài)變化，連續(xù)6 d。

1.3.6 AQP1-shRNA 感染雪旺細(xì)胞后水含量測(cè)定:根據(jù)Kletzien 等人的［3H］-3-氧-甲基-D-葡萄糖(OMG)方法測(cè)定細(xì)胞水含量［9－10］。在慢病毒感染后不同時(shí)間點(diǎn)，雪旺細(xì)胞內(nèi)加入1 mmol/L［3H］OMG(1.85 ×109Bq/L)0.05 mL，繼續(xù)放入二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育，30 min 后取出棄去孵育液，用含1 mmol/L根皮素(Phloretin)的冷Earle 氏液快速洗3遍終止反應(yīng)，加0.2 mol/L NaOH 消化，10 min 后取0.5 mL 用于液體閃爍計(jì)數(shù)，取0.1 mL 用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定(Lowry 氏法)，根據(jù)Kletzien 的方法換算成細(xì)胞內(nèi)水含量，結(jié)果以μL/mg 蛋白表示。

細(xì)胞內(nèi)水含量(μL/mg)=OMG 的μmol 數(shù)·g－1/OMG 的mmol 濃度

1.3.7 四唑藍(lán)(MTT)法測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25% 胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液，以1×104濃度接種于96 孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，加入AQP1-shRNA 感染細(xì)胞，設(shè)scr-shRNA 為CTRL 組，置37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h 后吸棄上清，向96孔板中依次加入MTT(終濃度為1 mg/mL)200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄上清液，加入150 μL/孔二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩10 min 后，以酶標(biāo)議450 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)光密度值(A450)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞(A450)/對(duì)照組細(xì)胞(A450)。

1.3.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)AQP1 干擾后細(xì)胞凋亡:慢病毒感染6 d 后，貼壁細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，培養(yǎng)液重懸成細(xì)胞懸液，將AQP1-shRNA 干擾組和CTRL 組(scr-shRNA)細(xì)胞用PBS 洗2 次，加入100 μL結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)和FITC 標(biāo)記的磷脂結(jié)合蛋白(Annexin-V)(20 mg/L)10 μL，室溫避光30 min，再加入碘化丙啶(PI)(50 mg/L)5 μL，避光反應(yīng)5 min 后，加入400 μL 結(jié)合緩沖液，立即采用流式熒光激活細(xì)胞分析(FACScan)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)(一般不超過1 h)，同時(shí)以不加AnnexinV-FITC 及PI 的一管作為陰性對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 成功培養(yǎng)出原代雪旺細(xì)胞

胰蛋白酶消化后，細(xì)胞懸浮，呈圓形，靜置24 h后細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈兩極形態(tài)，為梭形，突觸逐漸延長(zhǎng)，并與周圍細(xì)胞突觸交織呈網(wǎng)狀(圖1)。

2.2 所培養(yǎng)細(xì)胞免疫熒光染色證實(shí)表達(dá)AQP1

免疫熒光共標(biāo)法鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞同時(shí)表達(dá)AQP1 和S-100(圖2)。

圖1 原代培養(yǎng)雪旺細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)Fig 1 Morphology of primary Schwann cells(×100)

2.3 Real-time PCR 和Western blot 鑒定AQP1-shRNA 感染雪旺細(xì)胞后AQP1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平

較Blank 和scr-shRNA，AQP1-sh 能有效下調(diào)AQP1 mRNA 表達(dá)，下調(diào)效率約為65%(P＜0.05)(圖3A)?？瞻讓?duì)照組跟隨機(jī)序列對(duì)照組沒有差異，而AQP1-sh 實(shí)驗(yàn)組的AQP1 蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P＜0.05)(圖3B)。

2.4 AQP1-shRNA 對(duì)雪旺細(xì)胞形態(tài)的影響

AQP1-shRNA 感染原代雪旺細(xì)胞后每隔48 h 觀察細(xì)胞形態(tài)變化，前4 天AQP1-shRNA 組細(xì)胞與CTRL 組細(xì)胞形態(tài)無明顯差異，細(xì)胞均為梭形，第4天后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胞體開始皺縮，第6 天細(xì)胞胞體皺縮更明顯，細(xì)胞突觸更細(xì)長(zhǎng)(圖4)。

圖2 AQP1 和S-100 共標(biāo)免疫熒光染色Fig 2 Double immunostaining images of AQP1 expression in Schwann cells with anti-AQP1 antibody and anti-S-100 antibody(×400)

圖3 有效下調(diào)AQP1 基因的慢病毒載體感染雪旺細(xì)胞后的real-time 和Western blot 結(jié)果Fig 3 The effect of lentiviral-mediated knockdown of AQP1 expression in primary cultured Schwann cells

圖4 慢病毒感染雪旺細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)變化Fig 4 AQP1 knockdown induces alterations in Schwann cell morphology(×200)

2.5 AQP1-shRNA 對(duì)雪旺細(xì)胞水轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

AQP1-shRNA 處理4 及6 d 后細(xì)胞容積較對(duì)照組明顯降低(P＜0.01)(表1)。

表1 AQP1-shRNA 對(duì)體外培養(yǎng)雪旺細(xì)胞水含量的影響Table 1 AQP1-shRNA causes cell shrinkage in cultured Schwann cells by 38.9% at day 4 and 43.6%at day 6(±s，μL/mg，n=8)

表1 AQP1-shRNA 對(duì)體外培養(yǎng)雪旺細(xì)胞水含量的影響Table 1 AQP1-shRNA causes cell shrinkage in cultured Schwann cells by 38.9% at day 4 and 43.6%at day 6(±s，μL/mg，n=8)

Control (treated with scr-shRNA);* P＜0.01 compared with control group．

groupcell volume control3.54 ±0.30 AQP1SH(2 d)3.44 ±0.20 AQP1SH(4 d)2.11 ±0.22*AQP1SH(6 d)1.94 ±0.28*

2.6 AQP1-shRNA 對(duì)雪旺細(xì)胞增殖的影響

以轉(zhuǎn)染無意序列scr-shRNA 作為對(duì)照，AQP1-shRNA 轉(zhuǎn)染后雪旺細(xì)胞增殖活力降低(P＜0.05)(圖5)。

2.7 AQP1-shRNA 對(duì)雪旺細(xì)胞凋亡的影響

以Annexin V-FITC 和PI 雙標(biāo)記對(duì)雪旺細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果顯示，與CTRL 組比較，AQP1-shRNA 干擾組不會(huì)引起雪旺細(xì)胞明顯的早期和中晚期凋亡(圖6)。

圖5 AQP1-shRNA 對(duì)雪旺細(xì)胞增殖的影響Fig 5 Effect of AQP1-shRNA on Schwann cells proliferation

3 討論

臨床上周圍神經(jīng)損傷非常多見，牽拉傷、離斷傷、壓迫傷、感染等均會(huì)造成周圍神經(jīng)的水腫。而面神經(jīng)作為周圍神經(jīng)的一種，由于其解剖特殊，受骨性面神經(jīng)管壓迫，損傷后神經(jīng)水腫、神經(jīng)內(nèi)壓升高，致神經(jīng)缺血、缺氧，神經(jīng)內(nèi)膜通透性增加，血-神經(jīng)屏障功能破壞，神經(jīng)內(nèi)膜水腫，神經(jīng)內(nèi)壓進(jìn)一步升高，形成水腫-缺血-水腫的惡性循環(huán)，進(jìn)而加重面神經(jīng)的損傷，引起面癱癥狀，嚴(yán)重影響患者心理和生理健康，大大降低患者生存質(zhì)量。因此，如何預(yù)防或減輕面神經(jīng)的水腫在面癱早期治療中顯得尤為重要。

圖6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)AQP1-shRNA 感染后雪旺細(xì)胞凋亡情況Fig 6 Apoptosis rates of Schwann cells in AQP1-shRNA group and control group by flow cytometry

AQPs 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的研究較多，AQP1、AQP4 和AQP9 已被鑒定在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)，認(rèn)為其對(duì)腦水平衡的調(diào)節(jié)起重要作用，并且證實(shí)AQP4 是控制腦星形膠質(zhì)細(xì)胞快速水轉(zhuǎn)運(yùn)的主要因素，AQP4 改變是缺血誘導(dǎo)腦水腫的主要因素［11－14］;但AQPs 在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的功能研究卻鮮有報(bào)道。已有研究證實(shí)AQP1 是周圍神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)最多的水通道蛋白［4－7］，并發(fā)現(xiàn)AQP1 定位在周圍神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)表達(dá)陽性的雪旺細(xì)胞內(nèi);AQP1 也被發(fā)現(xiàn)在周圍神經(jīng)系統(tǒng)的背根神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)、結(jié)節(jié)性神經(jīng)節(jié)的膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。AQP1在周圍神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞的這種特定表達(dá)就像AQP4 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一樣。因此，本研究設(shè)想AQP1 在面神經(jīng)水腫中的作用類似于AQP4 在腦水腫中的作用。

雪旺細(xì)胞是周圍神經(jīng)的膠質(zhì)細(xì)胞，在周圍神經(jīng)的發(fā)生及損傷后的再生中發(fā)揮重要作用。本研究前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)面神經(jīng)組織內(nèi)表達(dá)AQP1，并發(fā)現(xiàn)AQP1 主要表達(dá)在神經(jīng)膜上，而且通過細(xì)胞免疫組化將AQP1 定位在原代培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞上。因此，此原代培養(yǎng)雪旺細(xì)胞可作為理想的細(xì)胞模型，為后續(xù)研究AQP1 在雪旺細(xì)胞及面神經(jīng)組織內(nèi)的基因功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。因慢病毒具有能感染非分裂細(xì)胞和終末分化細(xì)胞，病毒的VSVG 外殼使載體病毒顆粒具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性以及介導(dǎo)的RNAi 作用持久，能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)外源基因等優(yōu)點(diǎn)［15］。因此，本研究選擇慢病毒作為干擾載體，有效和特異地下調(diào)了小鼠原代雪旺細(xì)胞AQP1 表達(dá)，為研究AQP1 在面神經(jīng)水腫中的基因功能提供了條件。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AQP1-KD 處理的雪旺細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞明顯皺縮，細(xì)胞容積顯著降低，細(xì)胞突出變得更細(xì)、更長(zhǎng)，胞體也明顯縮小;并通過細(xì)胞增殖活力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AQP1-KD 會(huì)抑制細(xì)胞的增殖，但流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示AQP1-KD 不會(huì)引起雪旺細(xì)胞明顯的凋亡，而且病毒感染后細(xì)胞也未出現(xiàn)凋亡小體，說明細(xì)胞形態(tài)皺縮、水含量降低不是由于細(xì)胞凋亡引起。這些細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化則可能是因?yàn)樵谌狈QP1 轉(zhuǎn)運(yùn)情況下，細(xì)胞為了增加水通量而增加細(xì)胞表面積和體積比而出現(xiàn)。這些現(xiàn)象表明原代培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞需要功能性AQP1 表達(dá)來維持正常的細(xì)胞形態(tài)和良好的細(xì)胞生長(zhǎng);并且暗示水通道活性和細(xì)胞形態(tài)與AQP1 的功能密切相關(guān);說明AQP1是控制雪旺細(xì)胞快速水轉(zhuǎn)運(yùn)的主要因素，可為臨床治療面神經(jīng)水腫提供新的靶點(diǎn)。由于慢病毒可穩(wěn)定長(zhǎng)期表達(dá)外源基因，故下一步實(shí)驗(yàn)可應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染活體動(dòng)物，完成體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究AQP1 對(duì)治療早期面癱的臨床意義，為今后的臨床應(yīng)用提供可能。

［1］King LS，Yasui M．Aquaporins and disease:lessons from mice to humans［J］．Trends Endocrinol Metab，2002，13:355－360．

［2］Verkman AS．Physiological importance of aquaporins:lessons from knockout mice［J］．Curr Opin Nephrol Hypertens，2000，9:517－522．

［3］章杰，江華，蘆立軒，等．水通道蛋白在膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)及其意義［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，33:378－381．

［4］Gao H，He C，F(xiàn)ang X，et al．Localization of aquaporin-1 water channel in glial cells of the human peripheral nervous system［J］．Glia，2006，53:783－787．

［5］Nandasena BG，Suzuki A，Aita M，et al．Immunolocalization of aquaporin-1 in the mechanoreceptive Ruffini endings in the periodontal ligament［J］．Brain Res，2007，1157:32－40．

［6］Oshio K，Watanabe H，Yan D，et al．Impaired pain sensation in mice lacking Aquaporin-1 water channels［J］．Biochem Biophys Res Commun，2006，341:1022－1028．

［7］Shields SD，Mazario J，Skinner K，et al．Anatomical and functional analysis of aquaporin 1，a water channel in primary afferent neurons［J］．Pain，2007，131:8－20．

［8］章杰，江華，張盈帆，等．小鼠水通道蛋白1 基因shRNA慢病毒載體構(gòu)建與鑒定［J］．細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2013，29:48－53．

［9］Bender AS，Norenberg MD．Effect of benzodiazepines and neurosteroids on ammonia-induced swelling in cultured astrocytes［J］．J Neurosci Res，1998，54:673－680．

［10］Kletzien RF，Pariza MW，Becker JE，et al．A method using 3-O-methyl-D-glucose and phloretin for the determination of intracellular water space of cells in monolayer culture［J］．Anal Biochem，1975，68:537－544．

［11］Badaut J，Hirt L，Granziera C，et al．Astrocyte-specific expression of aquaporin-9 in mouse brain is increased after transient focal cerebral ischemia［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2001，21:477－482．

［12］Manley GT，F(xiàn)ujimura M，Ma T，et al．Aquaporin-4 deletion in mice reduces brain edema after acute water intoxication and ischemic stroke［J］．Nat Med，2000，6:159－163．

［13］Nicchia GP，F(xiàn)rigeri A，Liuzzi GM，et al．Inhibition of aquaporin-4 expression in astrocytes by RNAi determines alteration in cell morphology，growth，and water transport and induces changes in ischemia－ related genes［J］．FASEB J，2003，17:1508－1510．

［14］Oshio K，Watanabe H，Song Y，et al．Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1［J］．FASEB J，2005，19:76－78．

［15］Sakuma，Barry MA，Ikeda Y．Lentiviral vectors:basic to translational［J］．Biochem J，2012，443:603－618．