RUNX3與消化系腫瘤的研究進(jìn)展

武雪亮，王立坤，薛 軍*，賈光輝，屈 明，趙秀芳

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院1.血管腺體外科;2.超聲醫(yī)學(xué)科;3.病理科，河北張家口075000)

1 RUNX3 基因及蛋白的結(jié)構(gòu)和功能

RUNX3 基因定位于染色體1P36.1，有6 個(gè)外顯子和1 290 bp 的開(kāi)放閱讀框，全長(zhǎng)67 kb，mRNA有兩種變異剪切體，COS 區(qū)上游含有P1、P2 兩個(gè)啟動(dòng)子，負(fù)責(zé)RUNX3 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，且主要由P2 操縱。由于P2 啟動(dòng)子位于外顯子2 之前，GC 含量高(cytosine-phosphate-guanine，CpG)島，而CpG 島具有GC 啟動(dòng)子的特征，因而更易發(fā)生甲基化［1-2］。

RUNX3 蛋白是由α 和β 亞單位構(gòu)成的包含415 個(gè)氨基酸殘基的異二聚體，分子質(zhì)量約為44 ku。α 亞單位含有一個(gè)128 氨基酸組成的Runt domain(RD)保守域，位于氨基的末端。RD 內(nèi)含有一個(gè)S 形免疫球蛋白折疊，介導(dǎo)RD 與目標(biāo)基因DNA 的結(jié)合以及核心結(jié)合因子、蛋白之間的相互作用。β 亞單位由134 個(gè)氨基酸殘基組成，能增強(qiáng)RD 與目標(biāo)DNA 的結(jié)合力，維持其正常調(diào)控功能。RUNX3 蛋白的羧基端富含絲氨酸和脯氨酸，通過(guò)結(jié)合靶DNA 來(lái)調(diào)控RUNX3 的轉(zhuǎn)錄。

2 RUNX3 基因調(diào)控機(jī)制

研究證實(shí)，RUNX3 主要通過(guò)調(diào)控TGF-β 和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的形成(圖1)［3-5］。TGF-β 能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是多種細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制因子。RUNX3 是TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)的通路下游的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，其所含的RD 區(qū)域負(fù)責(zé)結(jié)合靶DNA。TGF-β 激活后與TGF-β 受體Ⅰ和Ⅱ(TpRⅠ和TpRⅡ)相結(jié)合，產(chǎn)生異四聚體復(fù)合物(TpRC)，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路。TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)主要是通過(guò)激活Smad 蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)的，TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)通路的配體、受體和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子Smad 蛋白組成一個(gè)抑制腫瘤信號(hào)的通路［6］。Smad 復(fù)合物須在RUNX蛋白(包括RUNX3 蛋白)的指導(dǎo)下，才能從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)入特定的靶位點(diǎn)，與RUNX 蛋白共同轉(zhuǎn)錄激活靶基因，從而對(duì)細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡和惡性轉(zhuǎn)化起作用。RUNX3 蛋白是P21 基因下游調(diào)控因子，RUNX3 和Smad3 協(xié)同表達(dá)時(shí)P21 啟動(dòng)子被激活，P21 能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞中促凋亡基因Biml 的轉(zhuǎn)錄和周期依賴激酶抑制因子P21WAFI 的表達(dá)，使細(xì)胞停滯于G1期，細(xì)胞增殖受抑制［7-8］。當(dāng)恢復(fù)RUNX3 的表達(dá)時(shí)，bcl-2 的表達(dá)出現(xiàn)了下調(diào)，并且P27、caspase3 和caspase9 的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，正是通過(guò)這樣的途徑，RUNX3 再次恢復(fù)對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Wnt 信號(hào)通路是調(diào)控機(jī)體胚胎及器官發(fā)育的重要信號(hào)通路之一，在細(xì)胞增殖、分化、極化、黏附和運(yùn)動(dòng)等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［9］;許多腫瘤的發(fā)病涉及經(jīng)典Wnt 通路的異常持續(xù)性激活。RUNX3可以與Wnt 信號(hào)通路的關(guān)鍵效應(yīng)器TCF4 和β-catenin 形成復(fù)合物，抑制TCF4-β-catenin 與靶DNA 的結(jié)合，從而減弱目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。

最新研究發(fā)現(xiàn)Wnt 信號(hào)通路是誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)產(chǎn)生的關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)通路。RUNX3 通過(guò)直接調(diào)控封閉蛋白-1 的轉(zhuǎn)錄參與EMT 的調(diào)控，保護(hù)失巢凋亡，從而抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究確定。此外，RUNX3 可以通過(guò)調(diào)節(jié)對(duì)VEGF 等參與血管生成的相關(guān)基因以及CRK-11、TIMP-1 等分子的表達(dá)抑制胃腸道腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力［10］。

3 RUNX3 與食管癌

應(yīng)用RT-PCR、免疫組化、MSP 等方法檢測(cè)60例食管鱗癌患者中的RUNX3 的表達(dá)情況，顯示在RUNX3 陰性組，RUNX3 的表達(dá)水平對(duì)患者預(yù)后的存活率有著明顯的影響，淋巴管的廣泛侵襲和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移數(shù)目顯著高于陽(yáng)性組［11］。用MSP 的方法分析在70 例食管鱗癌、20 例食管良性病變以及10例健康志愿者血清標(biāo)本中RUNX3 基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化情況，發(fā)現(xiàn)70 例食管鱗癌中RUNX3 基因啟動(dòng)子區(qū)域異常甲基化的有36 例，檢出率為51.4%;20 例食管良性病變中有2 例為不完全甲基化，檢出率為10%;而10 例健康志愿者檢出率為0。并且RUNX3 基因啟動(dòng)子甲基化與患者臨床病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)?？梢?jiàn)，RUNX3 基因啟動(dòng)子甲基化在食管鱗癌患者中有較高的檢出率，有望成為食管鱗癌早期診斷與預(yù)后監(jiān)測(cè)的重要標(biāo)記物［12］。

4 RUNX3 與胃癌

圖1 RUNX3 對(duì)消化系腫瘤的主要調(diào)控機(jī)制Fig 1 Regulation mechanism of RUNX3 in digestive system carcinoma

RUNX3 最早是在胃癌的標(biāo)本檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)的，其缺失或失活可導(dǎo)致胃腸黏膜上皮的過(guò)度增生和凋亡減少，以致胃黏膜上皮細(xì)胞增生和分化異常，導(dǎo)致癌變。去除了RUNX3 基因的小鼠胃黏膜上皮因RUNX3 蛋白的缺失使得胃黏膜上皮增殖過(guò)度旺盛而凋亡不足而呈增生狀態(tài)，導(dǎo)致了胃黏膜的異常增生發(fā)展為胃癌，且在該研究中發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞系在裸鼠的致癌性與RUNX3 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。應(yīng)用免疫組化對(duì)不同病理分期不同分化程度的胃癌組織及正常黏膜組織中RUNX3 蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，胃癌中RUNX3 蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率顯著低于正常胃黏膜細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在分化程度差、浸潤(rùn)深度深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于中高分化程度、浸潤(rùn)深度淺、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的表達(dá)［13］;幽門(mén)螺桿菌引發(fā)的原癌基因c-Src 的激活與RUNX3 基因表達(dá)的下調(diào)有關(guān)系，并且和RUNX3 酪氨酸磷酸化相關(guān)，RUNX3 表達(dá)缺失是幽門(mén)螺桿菌感染引發(fā)胃癌的病理機(jī)制的基礎(chǔ)事件［14］。在檢測(cè)的胃癌細(xì)胞系、胃癌組織及正常胃黏膜組織RUNX3 甲基化率中，70.0%(7/10)胃癌細(xì)胞系、45.2%(42/93)胃癌組織和7.5%(7/93)正常胃黏膜組織存在甲基化?？梢?jiàn)由于RUNX3 甲基化后，RUNX3 表達(dá)下調(diào)或缺失引起TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)通路紊亂，導(dǎo)致癌變，其中RUNX3 啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化是導(dǎo)致其在胃癌中失活的主要機(jī)制［15］。

5 RUNX3 與肝癌、膽管癌

應(yīng)用MSP 技術(shù)同時(shí)對(duì)5 種肝癌細(xì)胞系以及52例肝細(xì)胞癌患者腫瘤組織及其癌旁組織RUNX3 基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌組織中，RUNX3 基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化率占42.3%(22/52)，而在相對(duì)應(yīng)的正常結(jié)直腸組織中，RUNX3 基因啟動(dòng)子區(qū)域未發(fā)現(xiàn)高甲基化現(xiàn)象;在5種肝癌細(xì)胞系中，有3 種細(xì)胞RUNX3 基因啟動(dòng)子區(qū)域存在甲基化異常［16］;對(duì)人膽道腫瘤細(xì)胞系Mz-ChA-2 傳導(dǎo)RUNX3 的克隆實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)RUNX3 恢復(fù)并提高了TGF-β 依賴的G1 抑制［17］。用Northern免疫印跡和RT-PCR 技術(shù)分析顯示:在70%的膽管癌細(xì)胞系中不存在RUNX3 基因的表達(dá)，而在正常膽管細(xì)胞中卻可以檢測(cè)到RUNX3 mRNA 的表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在這些癌細(xì)胞中存在RUNX3 基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化，在90%的膽管癌中存在RUNX3基因的等位缺失［18］，說(shuō)明RUNX3 基因參與了肝癌、膽管癌的發(fā)生、發(fā)展與演變過(guò)程，并有可能與兩種病變的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移也有關(guān)系。

6 RUNX3 與胰腺癌

通過(guò)對(duì)12 個(gè)胰腺腫瘤細(xì)胞系行Northern blot和RT-PCR 分析，發(fā)現(xiàn)9 個(gè)(75%)都表現(xiàn)出RUNX3表達(dá)缺失。在RUNX3 表達(dá)缺失的腫瘤細(xì)胞系中檢測(cè)出啟動(dòng)子CpG 島的甲基化，且無(wú)RUNX3 mRNA的表達(dá)，提示RUNX3 失活在胰腺癌中，啟動(dòng)子區(qū)域甲基化是基因失活的重要機(jī)制［18］。

7 RUNX3 與結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌

研究60 例結(jié)直腸癌、60 例結(jié)直腸腺瘤、30 例正常組織中RUNX3 蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示RUNX3 蛋白在結(jié)直腸癌中表達(dá)陽(yáng)性率，遠(yuǎn)低于在結(jié)直腸腺瘤及正常組織中的表達(dá)，且RUNX3 蛋白的表達(dá)與其病理特征密切相關(guān)［19］。采用RT-PCR 和MSP 技術(shù)檢測(cè)了32 種結(jié)直腸癌細(xì)胞系和87 例癌組織中RUNX3 基因的突變、雜合性缺失和啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)有16 種癌細(xì)胞系存在RUNX3 基因表達(dá)缺失或下調(diào)，其中75%(12/16)存在啟動(dòng)子的高甲基化，在87 例癌組織中有16 例(18.4%)檢測(cè)到RUNX3 基因的甲基化，而在相應(yīng)的正常組織均未發(fā)現(xiàn)RUNX3 基因的甲基化［20］，說(shuō)明啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化是導(dǎo)致RUNX3 基因在結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的主要原因。并且有研究發(fā)現(xiàn)［21-22］對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞系給予去甲基化藥物AzA(5-aza-2'-deoxycytidine)處理后，腫瘤細(xì)胞系RUNX3 基因因去甲基化而激活，重新轉(zhuǎn)錄mRNA，RUNX3 蛋白表達(dá)增加，重新調(diào)控細(xì)胞的增殖，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，腫瘤凋亡率提高，這些研究結(jié)果在一定程度上支持了表觀基因?qū)W的論點(diǎn)。

8 RUNX3 基因與其他消化系統(tǒng)腫瘤的研究

目前，RUNX3 基因在小腸癌、胃間質(zhì)瘤、淋巴瘤等其他少見(jiàn)消化系腫瘤中的表達(dá)情況尚未在文獻(xiàn)中報(bào)道。

9 問(wèn)題與展望

值得肯定的是，RUNX3 基因能夠與Smads 相互作用，進(jìn)而調(diào)控TGF-β 信號(hào)通路介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制作用，也可以與TCF4 和β-catenin 形成復(fù)合物，抑制Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)通路的致癌作用。但尚有許多問(wèn)題還需進(jìn)一步研究，例如在Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)通路中，RUNX3 如何與其他因子相互作用來(lái)抑制癌細(xì)胞的產(chǎn)生，去甲基化藥物的使用是否可以使沉默的RUNX3 基因重新獲得表達(dá)從而抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)展，隨著遺傳學(xué)、表觀基因?qū)W及各種先進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法的不斷發(fā)展和改善，必將有助于對(duì)RUNX3 基因的抑癌機(jī)制進(jìn)行更深入的研究，從而為臨床預(yù)防、診療惡性腫瘤提供更科學(xué)的依據(jù)。

［1］Huang B，Qu Z，Ong CW，et al．RUNX3 acts as a tumor suppressor in breast cancer by targeting estrogen receptor α［J］．Oncogene，2012，31:527-534．

［2］Zhang Z，CHEN G，Cheng Y，et al．Prognostic significance of RUNX3 expression in human melanoma［J］．Cancer，2011，117:2719-2727．

［3］Liu LC，Tsao TC，Hsu SR，et al．EGCG Inhitits transforming growth factor-β-mediated epithelial-to-mesenchymal transition via the inhibition of Smad2 and Erk1/2 signaling pathways in nonsmal cell lung cancer cells［J］．J Agric Good Chem，2012，60:9863-9873．

［4］Calone I，Souchelnytskyi S．Inhibition of TGF-β signailing and its implications in anticancer treatments［J］．Exp Oncol，2012，34:9-16．

［5］Takashima P．Hartenstein V．Genetic control of intestinal stem cell specification and development:a comparative view［J］．Stem Cell Rev，2012，8:597-608．

［6］Soong R，Shah N，Peh BK，et al．The expression of RUNX3 in colorectal cancer is associated with disease stage and patient outcome［J］．Br J Cancer，2009，100:676-679．

［7］Shio S，Kodama Y，Ida H，et al．Loss of RUNX3 expression by histone deacetylation is associated with biliary tract carcinogenesis［J］．Cancer Sci，2011，102:776-783．

［8］Nakanishi Y，Shiraha H，Nishina S，et al．Loss of runt-related transcription factor expression leads hepatocellular carcinoma cells to escape apoptosis［J］．BMC Cancer，2011，11:3-10．

［9］曲琦，黃洪暉．經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路在惡性淋巴瘤中的研究進(jìn)展［J］．腫瘤，2012，32:940-944．

［10］Peng ZH，Wei DY，Wang LW，et al．RUNX3 inhibits the expression of vascular endothelial growth factor and reduces the angiogenesis，growth，and metastasis of human gastric cancer［J］．Clin Cancer Res， 2006，12:6386-6394．

［11］Tonomoto Y，Tachibana M，Dhar DK，et al．Differential expression of RUNX genes in human esophageal squamous cell carcinoma:downregulation of RUNX3 worsens patient progonisis［J］．Oncology，2007，73:346-351．

［12］鄭蕓，張有為，陳有邦．食管鱗癌患者血清RUNX3 基因甲基化檢測(cè)及臨床意義［J］．癌癥進(jìn)展，2010，8:290-294．

［13］朱興國(guó)，孟翔凌，王成宏，等．P16 蛋白、RUNX3 蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義［J］．安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45:93-97．

［14］Cinghu S，Goh YM，Oh BC，et al．Phosphorylation of the gastric tumor suppressor RUNX3 following H．pylori infection results in its localization to the cytoplasm［J］．J Cell physiol，2012，227:1071-1080．

［15］Imarnura Y，Hibi K，Koike M，et al．RUNX3 promoter region is specifically methylated in poorly-differentiated colorectal cancer［J］．Anticancer Res，2005，25:2627-2630．

［16］張海元，劉娟，解庭波，等．肝細(xì)胞癌中RUNX3 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化研究［J］．華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2009，38:23-26．

［17］Hasegawa K，Yazumi S，Wada M，et al．Restoration of RUNX3 enhances transforming growth factor-β-dependent p21 expression in a biliar-y tract cancer cell line［J］．Cancer Sci，2007，98:838-843．

［18］Wada M，Yazumi S，Takaishi S，et al．Frequent loss of RUNX3 gene expression in human bile duct and panereatic cancer cell lines［J］．Oncogene，2004，23:2401-2407．

［19］賈光輝，薛軍，武雪亮．RUNX3、Survivin 在結(jié)直腸腺癌、腺瘤、正常黏膜中表達(dá)的臨床意義［J］．安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48:1228-1231．

［20］Sugiura H，lshiguro H，Kuwabara Y，et al．Deereased expression of RUNX3 is eorrelated with tumor progression and poor prognosis in patients with esophageal squamous cell carcinoma［J］．Oncol Rep，2008，19:713-719．

［21］Deng T，Zhang Y．5-Aza-2'-deoxyeytidine reactivates expression of RUNX3 by deletion of DNA methyltransferases leading to caspase independent apoptosis in colorectal cancer Lovo cells［J］．Biomed Pharmacother，2009，63:492-500．

［22］張雪妍，蒲春霞，張煦．5-氮雜-2-脫氧胞苷誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2 RUNX3 基因表達(dá)及增強(qiáng)藥物敏感性［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2012，30:421-423．