siRNA沉默HBx基因對HepG2.2.15細胞遷移能力的影響

范 芳，莊 海，李長福

(遵義醫(yī)學院生化教研室，貴州遵義563099)

乙肝病毒(HBV)感染是肝癌的主要致病因素，HBx 在肝癌的發(fā)生發(fā)展、轉移浸潤過程中起著很重要的作用［1］。本研究應用RNAi 技術沉默HBx 基因表達，在體外觀察HBx 基因對HepG2.2.15 細胞遷移能力及DNA 合成的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞系和材料:肝癌細胞系HepG2.2.15(博慧斯生物技術公司);質?？蛰d體、pSIHBV/X(百奧邁科生物技術有限公司);Lipofectamine2000(Invitation 公司);Transwell 小室(Costar 公司);EdU 檢測試劑盒(廣州銳博公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及質粒轉染:實驗分為空白對照組、脂質體組(只加脂質體)、陰性對照組(轉染陰性對照質粒)和pSIHBV/X 干擾組(轉染質粒 pSIHBV/X)。轉染前收集HepG2.2.15 細胞，按2 ×104個/孔接種于24 孔板中，當細胞增殖匯合達60% ～70%時，利用脂質體轉染法將pSIHBV/X質粒轉入細胞(操作步驟同說明書)，轉染后再培養(yǎng)24、48 和72 h。

1.2.2 Real-time PCR 檢測HBx mRNA 的表達:細胞總RNA的提取按RNAiso Plus 試劑盒說明書進行，HBx 上游引物為:5'-ATCGGTACCATGGCTAGGTCG-3'，下游引物為3'-GTGGA AGCGGATTAGTACTTAAGAGG-5';內參β-actin 上游引物為:5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游引物為3'-CTAAGTC ATAGTCCGCCTAGAAGCA-5'。各組樣品mRNA 表達量經Real-time PCR 儀器檢測，PCR 產物作熔解曲線分析，根據Ct值通過公式2－(△△CT)進行相對定量分析，計算HBx mRNA 相對表達量。

1.2.3 Transwell 小室實驗:將Transwell 小室放入每孔加500 μL杜爾貝科改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基的24 孔板中孵育2 h，加入細胞懸液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉染24、48 和72 h 后取出小室，放入0.1%結晶紫的染液中染色15 min，用33%的醋酸溶液漂洗，顯微鏡下觀察并計數，每組細胞各取5 個視野，計數每個視野內穿膜的細胞數，計算平均值。

1.2.4 劃痕愈合實驗:轉染前在24 孔板底部用標記筆劃5條直線，轉染12 h 后，用10 μL 無菌吸頭在底部劃痕，將兩條直線間的細胞用細胞刮清理干凈，PBS 清洗2 ～3 遍，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24、48 和72 h 后，于倒置顯微鏡下觀察、拍照并記錄兩水平線間的細胞數。

1.2.5 細胞DNA 合成檢測:細胞轉染48 h，更換常規(guī)培養(yǎng)基并加入1 μL 5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷(Edu)孵育24 h后，4% 多聚甲醛固定15 min，PBS 沖洗2 次，0.5% Triton X-100處理細胞，加500 μL 染色反應液，室溫避光孵育30 min，加Hoechst 室溫避光孵育30 min，PBS 沖洗3 次后封片，在共聚焦熒光顯微鏡下拍照。每組細胞取5 個視野，用Image Pro Plus 軟件計數相同視野下EdU 標記細胞及總細胞數，計算DNA 合成率(DNA 合成率=EdU 標記細胞/總細胞數)。

2 結果

2.1 Real-time PCR 檢測HBx mRNA 表達情況:轉染pSIHBV/X 24、48 和72 h 后，實驗組HBx mRNA 的表達較其他對照組下調(P＜0.05)，pSIHBV/X 組48 和72 h 與空白對照組相比HBx 的沉默效率分別為39.42%和58.97%(圖1)。

2.2 Transwell 檢測細胞遷移情況:轉染24、48 和72 h 后實驗組細胞的遷移能力較對照組顯著下降(P＜0.05)(圖2)。

2.3 劃痕實驗:轉染48 和72 h 后實驗組細胞轉移數比對照組明顯減少(P＜0.05)(圖3)。

圖1 pSIHBV/X 干擾后HepG2.2.15 細胞中HBx mRNA 的表達Fig 1 Expressions of HBx mRNA in HepG2.2.15 cells after interfered by pSIHBV/X

圖2 pSIHBV/X 對HepG2.2.15 細胞遷移的抑制作用Fig 2 Inhibitory effect of pSIHBV/X on HepG2.2.15 cell migration

圖3 轉染pSIHBV/X 24、48 和72 h 后細胞轉移率Fig 3 The number of invasion after transfection pSIHBV/X of 24，48 and 72 hours

2.4 EdU 法檢測各組細胞DNA 合成情況:轉染pSIHBV/X 48 h 后干擾組細胞DNA 合成率顯著低于其他對照組(P＜0.05)(圖4)。

圖4 轉染48 h 后EdU 檢測結果Fig 4 EdU results after transfection for 48 hours

3 討論

本實驗通過脂質體轉染法將靶向HBx 基因的干擾質粒pSIHBV/X 轉染入肝癌細胞系HepG2.2.15 內，結果顯示，轉染pSIHBV/X 干擾質粒后HepG2.2.15 細胞中HBx mRNA 表達水平與對照組相比明顯下降，并能抑制HepG2.2.15 細胞的遷移運動能力，其機制可能與其上調VEGF 和MMP 的表達有關［2］。有研究表明HBx 可通過抑制蛋白降解途徑而影響細胞周期［3］。本研究應用EdU 法檢測轉染pSIHBV/X 質粒后各組細胞DNA 合成情況，結果顯示HBx 基因沉默后pSIHBV/X 組DNA 合成率下降，其具體機制還有待進一步深入研究。

［1］Gearhart TL，Bouchard MJ．The hepatitis B virus HBx protein modulates cell cycle regulatory proteins in cultured primary human hepatocytes［J］．Virus Res，2011，155:363-367．

［2］Liu LP，Liang HF，Chen XP，et al．The role of NF-kappaB in Hepatitis b virus X protein-mediated upregulation of VEGF and MMPs［J］．Cancer Invest，2010，28:443-451．

［3］Pandey V，Kumar V．HBx protein of hepatitis B virus promotes reinitiation of DNA replication by regulating expression and intracellular stability of replication licensing factor CDC6［J］．J Biol Chem，2012，287:20545-20554．