利用RIP-Chip篩選結合多聚胞嘧啶結合蛋白2的microRNAs

韓 為，林細華，陰 彬，彭小忠

(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院生物化學與分子生物學系醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室，北京100005)

多聚胞嘧啶結合蛋白2(PCBP2)是對多聚胞嘧啶［Poly(C)］具有高度親和性的RNA 結合蛋白，在胞核和胞質中穿梭表達［1］。通過對核心識別位點“ACCC”和“CCCU”的特異性結合［2］，PCBP2 參與到靶mRNA的穩(wěn)定性，選擇性剪接和翻譯調節(jié)［3］。近年來，有研究人員注意到microRNA(miRNA)也可以直接結合PCBP2 蛋白，通過“誘騙”機制干擾PCBP2 對靶mRNA的調控作用［4］。PCBP2 還可以與Dicer 酶相互作用，調節(jié)miRNA 生成［5］。本實驗室在前期工作中發(fā)現(xiàn)PCBP2 在人神經膠質瘤細胞中高表達。本研究通過核糖核蛋白免疫沉淀-芯片技術(RIP-Chip)在人正常神經膠質細胞(HA)和神經膠質瘤細胞(T98G 和U87MG)中篩選與(PCBP2)相互作用的miRNA。

1 材料與方法

1.1 材料

HA 細胞和AM 培養(yǎng)基(ScienCell 公司)，T98G和U87MG 細胞(美國模式培養(yǎng)物集存庫ATCC)，MEM/EBSS 和胎牛血清(Gibco 公司)，β-actin 抗體(Sigma 公司)，正常兔IgG、兔抗人PCBP2 抗體和RIP-Assay Kit for microRNA(MBL 公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自(北京中杉金橋生物技術有限公司)，ECL Western blot 發(fā)光檢測試劑、蛋白酶抑制劑、糖原和Protein A Agarose 瓊脂糖(Roche 公司)，RNA 酶抑制劑和DTT［寶生物工程(大連)有限公司］。

1.2 細胞培養(yǎng)

人正常星形膠質細胞HA 培養(yǎng)于含2%胎牛血清的AM 培養(yǎng)基中，人神經膠質瘤細胞T98G 和U87MG 培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基中。所有細胞置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按1∶2細胞每2 ～3 d 傳代1 次。

1.3 Western blot 檢測

收集3 種細胞系或這3 種細胞的RIP 蛋白樣品，98 ℃ 10 min 變性后－ 20 ℃保存。樣品經10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離約2 h 后，半干轉法轉移至硝酸纖維素膜上，5%高蛋白脫脂奶粉封閉30 min。按相應比例封閉一抗，室溫搖床孵育3 h，TBST 漂洗10 min ×3 次，與辣根過氧化物酶標記的二抗室溫搖床孵育1.5 h，TBST 漂洗10 min ×3次，ECL 顯色。

1.4 RIP 實驗

收集2×107個細胞，應用MBL 公司的RIP-Assay Kit for microRNA 制備核糖核蛋白復合物，加入適量蛋白酶抑制劑、DTT 和RNA 酶抑制劑，被Protein A珠子預清除1 h 后，上清均分兩部分，分別和過夜包被兔IgG 和PCBP2 抗體的Protein A 珠子4 ℃搖床孵育3 h。加入DTT 的漂洗液洗珠子4 次，取1/10 的珠子加適量上樣緩沖液，98 ℃10 min 變性后作為RIP蛋白樣品－20 ℃保存;剩余珠子按照試劑盒“兩步法”，糖原輔助醇沉RNA 過夜，70%乙醇洗沉淀2 次，10 μL DEPC 水溶解RNA，－80 ℃保存。

1.5 芯片雜交

樣品芯片雜交和數據分析均委托上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司完成，所用芯片為Affymetrix miRNA 3.0 芯片。RNA 利用NanoDrop ND-2100 (Thermo Scientific 公司)定量并經Agilent 2100 (Agilent Technologies 公司)檢測RNA 完整性。RNA 質檢合格后，樣本的標記、芯片的雜交以及洗脫參照芯片標準流程。

1.6 數據分析

實驗組為HA、T98G 和U87MG 細胞中PCBP2抗體RIP 的樣品;對照組為這3 種細胞中兔IgG 的RIP 樣品。差異miRNA 利用t 檢驗的P 值和倍數變化值進行篩選，篩選的標準為上調倍數變化值＞4且P＜0.05。

2 結果

2.1 檢測PCBP2 蛋白在3 種細胞內的表達

應用MBL 公司的RIP 級PCBP2 抗體在HA、T98G 和U87MG 細胞中通過Western blot 檢測PCBP2 蛋白的表達，β-actin 作為上樣內參。結果顯示，該抗體可以特異地與細胞內PCBP2 兩種剪接形式結合，并且PCBP2在神經膠質瘤細胞中的總體表達水平高于正常星形膠質細胞，與實驗室前期結果一致(圖1)［6］。

圖1 PCBP2 蛋白在人星形膠質細胞(HA)和神經膠質瘤細胞系(T98G 和U87MG)中的表達水平Fig 1 Expression of PCBP2 protein levels in human astrocyte (HA)and glioma cell lines(T98G，U87MG)

2.2 檢測PCBP2 抗體RIP 實驗的質量

利用PCBP2 抗體在上述3 種細胞中進行RIP實驗，正常兔IgG 作為實驗的陰性對照，分別收集實驗組和對照組的蛋白、RNA 樣品進行質量檢測。Western blot 結果顯示:與兔IgG 相比，通過PCBP2抗體的RIP 實驗可以高效穩(wěn)定地富集到目的蛋白(圖2A);利用NanoDrop ND-2100 對RNA 定量分析:HA(IgG)0.5 μg，HA(PCBP2)0.3 μg，U87MG(IgG)1 μg，U87MG(PCBP2)1 μg，T98G(IgG)1 μg，T98G(PCBP2)3 μg;利用Agilent 2100 檢測PCBP2抗體RIP 下來的RNA 完整性:HA 細胞(28S/18S =2.5，RIN = 9.4)，U87MG(28S/18S = 2.7，RIN =8.9)，T98G 細胞(28S/18S = 2.7，RIN = 9.2)(圖2B)。質檢結果符合芯片要求。

2.3 RIP-Chip 分析和PCBP2 蛋白相互作用的miRNA

本研究中使用的是Affymetrix GeneChip miRNA 3.0 芯片，該芯片覆蓋miRNA V17.0 數據庫，可以檢測153 個物種的miRNA，總探針數19913 條，其中包括人屬的1789 條成熟miRNA、1693 條miRNA 前體(pre-miRNA/stem-loop)及2336 條核仁小分子RNA(snoRNA)和卡哈爾體小分子RNA(scaRNA)。3 種細胞的芯片檢出率分別是HA(IgG 10.79%，PCBP2 17.98%)、U87MG (IgG 12.56%，PCBP2 17.24%)和T98G(IgG 11.63%，PCBP2 22.45%)。根據3 組芯片數據，最終篩選得到富集4 倍以上且P值＜0.05 的miRNA 一共105 條，包括1 條snoRNA、1條前體miRNA 和103 條成熟miRNA(表1)。另外還發(fā)現(xiàn)其中有15 條miRNA 序列存在PCBP2 蛋白核心識別位點(表2)。

圖2 RIP 樣品的質量檢測Fig 2 Quality control of RIP samples

表1 利用PCBP2 抗體富集與PCBP2 結合的105 條microRNATable 1 The 105 miRNAs enriched in the PCBP2 associated miRNA population over rabbit IgG

續(xù)表1

表2 包含PCBP2 核心識別位點的15 條microRNATable 2 15 microRNAs contained the core PCBP2 recognition sites

3 討論

RIP 技術是研究細胞內RNA 與蛋白結合情況的技術，是了解轉錄后調控網絡動態(tài)過程的有力工具［7］。RIP 技術下游結合芯片技術被稱為RIPChip。隨著芯片技術的發(fā)展，RIP 既可用來分析mRNA 也可以用來分析miRNA 和蛋白的相互作用，能幫助我們更高通量地了解癌癥以及其他疾病整體水平的RNA 變化［8］。

本研究的目的蛋白PCBP2 是核內不均一核糖核蛋白家族重要成員，在實驗室前期工作中通過RIP-Chip 鑒定了其在神經膠質瘤細胞中35 條mRNA 靶標，并且驗證了靶基因FHL3 受PCBP2 負調控參與膠質瘤惡性進展［6］。當時采用的是基因表達譜芯片，本次研究利用RIP 試劑盒二步法分離miRNA，可以更高效地富集80 bp 以下的RNA，結合miRNA 表達芯片，可以高通量地分析PCBP2 在細胞內結合的成熟miRNA 和前體miRNA。

通過芯片分析結果，發(fā)現(xiàn)PCBP2 不但可以結合胞質中的miRNA，還可以在核內與某些snoRNA 相互作用。另外，本研究還首次發(fā)現(xiàn)PCBP2 可以結合前體和成熟的miR-423，說明miR-423 的生成過程可能依賴PCBP2 的調控。而以前文獻報道過可以直接結合PCBP2 的miR-328［4］也在本實驗的芯片結果中。除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)14 條存在PCBP2核心識別序列的miRNA，這也暗示PCBP2 與miRNA 之間的調節(jié)作用存在多樣性:PCBP2 可以被“誘騙”直接結合某些miRNA 或者“誘騙”miRNA 與其結合進而調節(jié)該miRNA 的靶基因表達;更多的調節(jié)機制則可能是PCBP2 通過核糖核蛋白復合物或者共同的靶mRNA 與miRNA 相互作用。

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