小鼠脊髓損傷后周細(xì)胞促進(jìn)脊髓血管新生

荊瀛黎，武清斌，苑曉晨，李炳蔚，劉明明，張曉艷，劉淑英，李宏偉，修瑞娟

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生部微循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室微循環(huán)研究所，北京100005)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)可導(dǎo)致血管破裂和血管內(nèi)皮細(xì)胞丟失。血管損傷可繼發(fā)性引起缺氧、缺血和炎性反應(yīng)等病理反應(yīng)。研究表明脊髓損傷后的血管新生有利于患者運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù);血管密度增加與運(yùn)動(dòng)功能的提高密切相關(guān)［1-2］。

周細(xì)胞定位在微血管表面，對(duì)血管新生、血管重塑及穩(wěn)定性等均有重要作用［3］。脊髓微血管周細(xì)胞覆蓋率較外周組織更高，提示脊髓周細(xì)胞可能具有更為重要的功能［3-4］。近年來，已有學(xué)者關(guān)注周細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理變化中的作用，如腦缺血時(shí)周細(xì)胞大量丟失［5］，提示周細(xì)胞缺失可能與腦、脊髓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)微血管功能異常有關(guān)［6］。本研究擬探討周細(xì)胞在脊髓損傷后脊髓微血管新生中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑:FITC-番茄凝集素(lycopersicon esculentum agglutinin lectin，LEA)(Sigma 公司);兔單克隆PDGFRβ 抗體、兔多克隆CD13 抗體和山羊單克隆CD31 抗體(Abcam 公司);FITC-標(biāo)記的山羊抗兔抗體和TRITC-標(biāo)記的兔抗山羊抗體(Santa Cruz 公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF 級(jí)雄性C57BL/6(18 ～22 g)小鼠36 只［中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，許可證號(hào)SCXK(京)2009-0007］。本實(shí)驗(yàn)方案已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院微循環(huán)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 脊髓損傷小鼠模型的建立及分組:將36 只小鼠隨機(jī)分為椎板切除術(shù)組(sham 組)，損傷后2、7和14 d 組(S2、S7 和S14 組)，9 只/組。俯臥位固定并麻醉小鼠，參照文獻(xiàn)［7-8］中方法對(duì)T10 脊髓行椎板切除術(shù)，制備脊髓損傷模型，以鼠尾出現(xiàn)無規(guī)則痙攣性擺動(dòng)為造模成功標(biāo)志。

1.2.2 血管內(nèi)注射凝聚素(FITC-LEA)檢測(cè)灌注血管:麻醉，仰臥位固定小鼠，右側(cè)頸外靜脈插管，注射100 μg/100 μL FITC-LEA，體內(nèi)循環(huán)30 min 后，灌流取材。

1.2.3 圖像分析:冰凍切片的免疫熒光檢測(cè)血管面積，冰凍切片的免疫組化檢測(cè)血管密度。計(jì)算LEA/CD31 標(biāo)記的微血管(直徑＜100 μm)面積，LEA/CD31 標(biāo)記的微血管面積與照片中整個(gè)視野的面積比值即為灌注血管的百分?jǐn)?shù)。覆蓋在微血管上PDGFRβ/CD13 陽性細(xì)胞面積與CD31 標(biāo)記微血管面積的比值即為周細(xì)胞的覆蓋率。

1.2.4 成管能力的測(cè)定:將脊髓微血管內(nèi)皮細(xì)胞和/或脊髓微血管周細(xì)胞接種于包被好的96 孔板中。8 h 后分別觀察正常和缺氧條件下(95% N2和5% CO2)的成管情況，以成管總長(zhǎng)度來衡量成管能力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，符合正態(tài)分布的用t 檢驗(yàn)或單因素方差分析，非正態(tài)分布資料用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠SCI 后灌注血管的變化

假手術(shù)組脊髓組織的白質(zhì)和灰質(zhì)中可見明顯的灌注血管，尤其是高度血管化的灰質(zhì)，S2 組灌注血管數(shù)明顯降低，S14 組灌注血管有所回升(圖1A)。3 組的灌注微血管面積顯著低于假手術(shù)組(P＜0.001，P＜0.01)。與S2 組相比，S14 組灌注血管面積明顯回升(P＜0.05)(圖1B)。

2.2 小鼠SCI 后微血管的變化

圖2A 顯示，與假手術(shù)組比，S2 組CD31-免疫陽性內(nèi)皮細(xì)胞明顯降低，反映了血管數(shù)顯著下降，S7、S14 組血管數(shù)逐漸增加。3 組的微血管面積顯著低于假手術(shù)組(P＜0.001，P＜0.05)。與S2 組相比，S7、S14 組微血管面積顯著回升(P＜0.05，P＜0.01)(圖2B)。

2.3 小鼠SCI 后微血管密度的變化

圖3A 顯示，與假手術(shù)組相比，S2 組微血管密度明顯降低，而S7 與S14 組血管密度均有不同程度的增加。S2 和S7 組的微血管密度顯著低于假手術(shù)組(P＜0.01，P＜0.05)。S14 組微血管密度回升并接近正常。與S2 組相比，S7、S14 組微血管密度顯著回升(P＜0.05，P＜0.01)(圖3B)。

2.4 小鼠SCI 后周細(xì)胞覆蓋率的變化

與假手術(shù)組相比，S2 和S7 組周細(xì)胞覆蓋率顯著降低，S14 組周細(xì)胞在微血管的定位不清，無法統(tǒng)計(jì)(圖4A，B)。S2 和S7 組的周細(xì)胞覆蓋率顯著低于假手術(shù)組(P＜0.001)。與S2 組相比，S7 組周細(xì)胞覆蓋率顯著下降(P＜0.05)，S14 周細(xì)胞在微血管上的定位不清，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(圖4C，D)。

圖1 小鼠SCI 后LEA 標(biāo)記微血管的變化情況Fig 1 The alteration of LEA-labeled micro-vessels after SCI in mice

圖2 小鼠SCI 后CD31 標(biāo)記微血管的變化情況Fig 2 The alteration of CD31-labeled micro-vessels after SCI in mice

圖3 小鼠SCI 后微血管密度的變化情況Fig 3 The alteration of micro-vessel density after SCI in mice

圖4 小鼠SCI 后PDGFRβ 陽性或CD13 陽性周細(xì)胞覆蓋率的變化Fig 4 The alteration of PDGFRβ-positive or CD13-positive pericyte coverage after SCI in mice

圖5 周細(xì)胞促進(jìn)缺氧條件下內(nèi)皮成管Fig 5 Pericytes promote endothelial tubular formation under anoxia

2.5 周細(xì)胞促進(jìn)缺氧條件下內(nèi)皮成管

缺氧環(huán)境可顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞成管，內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞共培養(yǎng)可逆轉(zhuǎn)缺氧對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞成管的破壞(圖5A)。不同比例(1∶1 或1∶10)周細(xì)胞的加入均可顯著增加缺氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞的成管長(zhǎng)度(P＜0.01)(圖5B)。

3 討論

脊髓損傷早期，大量?jī)?nèi)皮細(xì)胞丟失，機(jī)體通過血管新生進(jìn)行內(nèi)源性損傷修復(fù)。內(nèi)源性損傷修復(fù)未提供充足的血液供應(yīng)，使損傷部位持續(xù)處于缺氧、缺血狀態(tài)，導(dǎo)致脊髓組織細(xì)胞進(jìn)一步死亡。本研究表明脊髓損傷后血管面積和血管密度進(jìn)行性增加，可能與上述內(nèi)源性損傷修復(fù)有關(guān)。

周細(xì)胞覆蓋率的降低伴隨血管密度的下降，血管直徑增加、迂曲、灌注降低等不正常特征可能為脊髓損傷早期脊髓微循環(huán)的病理改變。周細(xì)胞在缺氧條件下能促進(jìn)內(nèi)皮的成管，提示脊髓損傷后血管新生水平的不足可能與周細(xì)胞覆蓋率的降低有關(guān)。周細(xì)胞覆蓋率可能決定了脊髓損傷時(shí)脊髓微血管的灌注水平。有研究表明，成年小鼠血管壁上周細(xì)胞募集的降低會(huì)引起微血管灌注不足和血腦屏障障礙［9］。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷小鼠周細(xì)胞覆蓋率的降低與新生血管較低灌注水平有關(guān)，提示周細(xì)胞覆蓋率對(duì)脊髓損傷后新生微血管的灌注水平具有重要意義，提高脊髓周細(xì)胞覆蓋率可能有助于脊髓損傷修復(fù)的進(jìn)行。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞成管功能及脊髓損傷后內(nèi)源性損傷修復(fù)可能與脊髓周細(xì)胞密切相關(guān)。因此，周細(xì)胞可作為脊髓損傷修復(fù)的治療新靶點(diǎn)之一，脊髓微循環(huán)及脊髓周細(xì)胞在脊髓損傷修復(fù)中的機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

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