華蟾素注射液抗肝癌細胞多藥耐藥性的蛋白質(zhì)組學分析

韋 艷，盧 珩，王榮榮，陸艷玲，梁 鋼

(1.武警廣西總隊醫(yī)院藥劑科，廣西南寧530003;2.廣西醫(yī)科大學藥學院藥理教研室，廣西南寧530021)

華蟾素為干蟾皮的水化萃取物，其主要活性成分為蟾毒內(nèi)酯類化合物，包括蟾毒靈、脂蟾蜍配基、華蟾酥毒基等。華蟾素注射液(cinobutacini injection，CINO)臨床上主要用于中、晚期腫瘤以及乙型肝炎等疾病，尤其在對肝癌的治療中有顯著的效果［1-2］。廣西是肝癌高發(fā)地區(qū)，中藥逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)的研究已成為一個熱點。有研究報道華蟾素降低P-糖蛋白表達而降低人乳腺細胞耐藥［3］，同時肝癌MDR 機制是多途徑多通路的，本實驗以華蟾素注射液逆轉(zhuǎn)肝癌細胞潛在多藥耐藥相關(guān)蛋白質(zhì)為主要研究內(nèi)容，利用雙向電泳及質(zhì)譜分析技術(shù)，篩選華蟾素注射液作用于肝癌耐藥細胞前后的表達差異蛋白，分析華蟾素逆轉(zhuǎn)肝癌細胞多藥耐藥性的潛在分子機制，為臨床聯(lián)合用藥以減少耐藥的產(chǎn)生提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試劑

耐5-氟尿嘧啶細胞Bel-7402/FU(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);華蟾素注射液(安徽金蟾生化股份有限公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，PBS 緩沖液清洗細胞，0.25%胰蛋白酶消化傳代，置37 ℃、5 % CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細胞增殖情況，取對數(shù)增殖期細胞用于實驗。

1.3 MTT 法檢測華蟾素注射液的細胞敏感性及耐藥逆轉(zhuǎn)作用

濃度為1 × 105個/mL 的耐5-氟尿嘧啶細胞的單細胞懸液種于同一96 孔板中，每孔100 μL，設(shè)5個平行孔，培養(yǎng)過夜，加入的華蟾素注射液濃度為:0.035、0.07、0.14、0.28、0.56、1.12 和2.24 μg/mL，設(shè)陰性及空白對照，最終體積200 μL。48 h 后，加入5 g/L MTT 20 μL，4 h 后棄培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO。酶標儀選擇波長492 nm 測吸光度值(A492)，不同日重復4 次實驗取均數(shù)。計算細胞抑制率(IR)，IR(%)=(A492對照－A492試驗)/(A492對照－A492空白)×100%，LOGIT 軟件計算求得華蟾素注射液50 % 抑制濃度(IC50)。梯度濃度5-氟尿嘧啶(fluorouracil，5-FU)(26、52、104、208、416 和832 μg/mL)分別聯(lián)合0.08、0.16 和0.32 μg/mL 華蟾素注射液進行耐藥逆轉(zhuǎn)實驗，5 mg/L 維拉帕米(Verapamil，VRP)為陽性對照;同時設(shè)陰性和空白對照孔，按前述MTT 方法，CINO 逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)(reverse fold，RF)= 5-FU 的IC50/ (5-FU +CINO)共同作用下IC50。

1.4 2-DE 檢測華蟾素注射液作用于耐藥細胞后蛋白質(zhì)的表達變化

實驗分為Bel-7402/FU 組和Bel-7402/FU+ CINO 組(0.26 μg/mL CINO 培養(yǎng)48 h)。細胞用PBS清洗，加入蛋白裂解，提取總蛋白。蛋白質(zhì)定量試劑盒進行定量。取樣品蛋白進行固相pH 梯度膠條水化，設(shè)置IPGphor 儀器的運行參數(shù)，等電聚焦，程序結(jié)束后取出膠條進行平衡，將平衡好的膠條覆蓋瓊脂糖溶液后開始電泳。硝酸銀染色，染色后的凝膠經(jīng)ImageScanner 掃描儀掃描獲得蛋白質(zhì)點圖譜，所得圖譜用Image Master 2-DE Platinum 5.0 軟件分析。分別將同種細胞3 次電泳所得的蛋白質(zhì)點圖譜在軟件中創(chuàng)建平均膠，以其中一組的平均膠為參照膠與另一組的平均膠進行匹配。蛋白點灰度值差異達到2.5 倍以上認定為差異蛋白。將差異蛋白質(zhì)點切下，交由廣西大學生命科學院進行基質(zhì)輔助激光解析電離化/飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)檢測聯(lián)合肽質(zhì)量指紋譜分析，通過rNCBI 數(shù)據(jù)庫獲取蛋白質(zhì)點的信息。

1.5 Western blot 法檢測蛋白質(zhì)在各組細胞中的表達差異

提取的蛋白樣品進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為7%，濃縮膠濃度為4%。采用濕法轉(zhuǎn)膜，200 mA 恒流，轉(zhuǎn)移2 h。5%BSA 封閉4 ℃過夜，與一抗、二抗雜交反應(yīng)后，HRP-ECL 顯影，掃描后應(yīng)用quantity-one 軟件分析。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0 軟件分析，計量數(shù)據(jù)以均值±標準差(±s)表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 法。

2 結(jié)果

2.1 華蟾素注射液的細胞敏感性及耐藥逆轉(zhuǎn)作用

濃度為0.035、0.07、0.14、0.28、0.56、1.12和2.24 mg/L 的CINO 對細胞Bel-7402/FU 的抑制率(%)分別為:6.79 ± 0.05、10.58 ± 0.02、17.97 ±0.04、26.84 ±0.03、45.27 ±0.03、63.68 ±0.03 和77.91 ±0.05。CINO 對細胞的IC50為0.66 mg/L。5-FU對細胞的IC50及其分別聯(lián)合0.08、0.16 和0.32 mg/L華蟾素注射液后對細胞的IC50見表1。

表1 CINO 對Bel-7402/FU 的逆轉(zhuǎn)耐藥性濃度依賴影響Table 2 The dose-dependent reversal effects of CINO on Bel-7402/FU(±s，n=4)

表1 CINO 對Bel-7402/FU 的逆轉(zhuǎn)耐藥性濃度依賴影響Table 2 The dose-dependent reversal effects of CINO on Bel-7402/FU(±s，n=4)

drug(mg/L)Bel-FU IC50(mg/L)RF 5-FU290.97 ±1.11－5-FU+0.08 CINO186.54 ±0.901.56* #5-FU+0.16 CINO133.52 ±0.632.18* #5-FU+0.32 CINO97.25 ±0.662.99* #5-FU+ VRP210.98 ±1.071.38

2.2 2-DE 凝膠圖譜

經(jīng)Image Master 2-DE Platinum 5.0 軟件分析，Bel-7402/FU 組與Bel-7402/FU+ CINO 組兩對凝膠進行兩兩匹配分析，尋找灰度值差異在2.5 倍以上的差異點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CINO 作用Bel-7402/FU 細胞后，13 個蛋白表達量發(fā)生下調(diào)，分別編號為2、3、9、10、15、32、33、35、36、e1、e2、e3 和e4。有1 個蛋白點表達上調(diào)，編號為30。Bel-7402/FU 組和Bel-7402/FU+CINO 組雙向凝膠電泳圖譜見圖1。

2.3 差異表達蛋白質(zhì)的質(zhì)譜檢測結(jié)果

經(jīng)肽質(zhì)量指紋譜分析聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解析電離化/飛行時間質(zhì)譜檢測對14 個差異表達的候選蛋白進行鑒定，成功鑒定了3 個差異表達蛋白(圖2)，通過搜索NCBInr 數(shù)據(jù)庫，獲取各蛋白質(zhì)點信息(表2)，其余因無法得到好的肽指紋圖譜或者數(shù)據(jù)庫搜索時匹配結(jié)果可信度過低而暫時未能鑒定。

圖1 CINO 作用Bel-7402/FU 前后雙向凝膠電泳圖譜Fig 1 The two-dimensional electrophoregram of Bel-7402/FU treated withCINO

圖2 差異表達蛋白FAK、CRT 和TMOD3Fig 2 The differential expression protein FAK，CRT and TMOD3

表2 各差異蛋白質(zhì)點信息Table 2 Information of the differential expression protein

2.4 Western blot 檢測

蛋白FAK、CRT 和TMOD3 的表達耐藥細胞Bel-7402/FU 以及CINO 作用于耐藥細胞中蛋白FAK、CRT 表達變化情況見圖3。各組細胞樣品蛋白中FAK /β-actin、CRT /β-actin 和TMOD3/β-actin比值見表3。

圖3 Western blot 檢測FAK、CRT 和TMOD3蛋白表達Fig 3 Western blot recults of FAK，CRT and TMOD3

表3 FAK、CRT 表達水平變化Table 3 The differential expression levels of FAK and CRT(±s，n=4)

表3 FAK、CRT 表達水平變化Table 3 The differential expression levels of FAK and CRT(±s，n=4)

*P＜0.05 compared with Bel-7402/FU+ CINO．

ratioBel-7402/FUBel-7402/FU+ CINO FAK/β-actin1.15 ±0.06*0.65 ±0.03 CRT/β-actin1.24 ±0.03*0.59 ±0.04 TMOD3/β-actin1.31 ±0.04*0.78 ±0.09

3 討論

從結(jié)果中可知，有13 個蛋白質(zhì)點在耐藥細胞中高表達，經(jīng)華蟾素注射液作用后表達下調(diào)，經(jīng)質(zhì)譜鑒定了3 個蛋白質(zhì)點，分別為:黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)、鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)、原肌球調(diào)節(jié)蛋白3(tropomodulin 3，TMOD3)。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，多藥耐藥腫瘤細胞中的FAK、CRT、TMOD3 表達增加［4］。FAK 蛋白表達的增高預示腫瘤細胞間的黏附與群集作用增強［5］，而細胞間黏附這一重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是實體腫瘤在體內(nèi)群集而產(chǎn)生耐藥的原因之一，在肝癌病例中FAK 蛋白表達與其死亡風險及生存率有密切關(guān)系［6］，經(jīng)華蟾素注射液作用后其表達下調(diào)，可干預腫瘤耐藥細胞的聚集及黏附從而促進其凋亡。CRT 具有多種生物學功能，包括調(diào)節(jié)鈣平衡、協(xié)助蛋白質(zhì)的加工折疊、參與抗原提呈、血管的發(fā)生及細胞的凋亡等［7］。近年許多體外及動物實驗均證實，多種腫瘤中CRT 表達有特異性的增加，是一個潛在的腫瘤標志物［8］。CRT 表達的下調(diào)對華蟾素注射液對抗腫瘤細胞的多藥耐藥性機制研究有重要的意義。TMOD3 在維持細胞骨架結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性及促進細胞分化過程中有重要作用［9-10］，但在腫瘤耐藥中的作用并不清楚，華蟾素注射液是否通過下調(diào)TMOD3 表達、影響腫瘤細胞結(jié)構(gòu)及增殖分化以逆轉(zhuǎn)MDR 還有待進一步的探討與研究。

從細胞毒性實驗來分析，華蟾素注射液對多藥耐藥細胞具有顯著的對抗作用，由于MDR 的機制是多途徑、多通道的，華蟾素注射液通過下調(diào)FAK、CRT 和TMOD3 表達以逆轉(zhuǎn)MDR 的機制是有限的，在下一步的研究中，將華蟾素注射液改變表達的其余蛋白進行鑒定，進一步豐富和完善其對抗腫瘤細胞MDR 機制理論。

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