轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究概述

陳銳等

摘 要：轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用與發(fā)展十分迅猛，相應(yīng)的檢測技術(shù)體系也在不斷更新與進(jìn)步。本文從檢測技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)兩個(gè)方面對當(dāng)前轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)體系的研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢進(jìn)行了概述。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因；檢測技術(shù)；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

中圖分類號：S188 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.03.003

轉(zhuǎn)基因技術(shù)在提高作物抗性、增加糧食產(chǎn)量、改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)以及減少農(nóng)藥使用與污染等方面正深刻改變著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積已達(dá)1.7億hm2，超過全球耕地面積的10%，共計(jì)60個(gè)國家和地區(qū)累計(jì)審批1 045項(xiàng)轉(zhuǎn)基因作物用于食品、飼料和環(huán)境釋放，涉及25個(gè)物種、196個(gè)轉(zhuǎn)化事件[1]。伴隨轉(zhuǎn)基因作物種植面積的激增，關(guān)于轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品成分對人類健康和生態(tài)環(huán)境影響的關(guān)注度也與日俱增。

目前國際上在轉(zhuǎn)基因檢測與標(biāo)識管理方面已形成部分共識性文件、評價(jià)原則及檢測標(biāo)準(zhǔn)，但因不同國家和地區(qū)的國情與政策導(dǎo)向不同，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品在標(biāo)簽的閾值范圍、標(biāo)識方式等管理制度上還存在較大差異[2-4]。不同的標(biāo)識制度直接關(guān)系到轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的進(jìn)出口檢驗(yàn)、國際貿(mào)易互認(rèn)等諸多問題，加之公眾對轉(zhuǎn)基因食品越來越關(guān)注，轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)近年來得到了快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。筆者就轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究現(xiàn)狀進(jìn)行概述。

1 轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)概況

轉(zhuǎn)基因檢測的對象主要是外源插入基因的核酸序列或其蛋白表達(dá)產(chǎn)物。針對蛋白的檢測，因其抗體制備成本較高，并且由于外源基因的低水平和時(shí)空特異性表達(dá)、蛋白的不穩(wěn)定性，以及多種干擾免疫應(yīng)答物質(zhì)的存在，使蛋白檢測的應(yīng)用范圍受到一定程度的限制。針對核酸的檢測方法靈敏度高、適用范圍廣，是當(dāng)前轉(zhuǎn)基因檢測的主流方法。按目的轉(zhuǎn)基因檢測可分成3個(gè)層次：一是通過檢測通用的遺傳元件來初步篩查樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分；二是針對轉(zhuǎn)化事件的指定特征進(jìn)行品系特異性鑒定；三是定量分析轉(zhuǎn)基因成分所占比重。

1.1 針對核酸的檢測技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增技術(shù)（Polymerase chain reaction， PCR）是目前應(yīng)用最廣泛的轉(zhuǎn)基因檢測方法，具有高度特異性和靈敏度，可用于定性或定量分析[5]。PCR法按檢測對象可分為元件特異性（如p35S、tNOS）[6]、基因特異性（如cry1Ab，cp4-epsps）[7]、構(gòu)建特異性[8]和品系特異性4種[9-11]。在標(biāo)準(zhǔn)PCR方法基礎(chǔ)上還存在多種改良方法，多重PCR、巢式PCR、半巢式PCR在降低成本、提高通量和靈敏度方面具備優(yōu)勢[12]。反向PCR（Inverse PCR）[13]，熱不對稱PCR（Thermal asymmetric interlaced PCR， TAIL-PCR）[14]和連接介導(dǎo)PCR（Ligation mediated PCR， LM-PCR）[15-16]在側(cè)翼序列擴(kuò)增和鑒定方面應(yīng)用廣泛。

定量PCR（Quantitative PCR， qPCR）是目前最有效的轉(zhuǎn)基因定量檢測方法，包括競爭定量PCR[17]和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法[18-19]，其中后者利用熒光標(biāo)記可實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增過程，根據(jù)待測物初始濃度與Ct（Threshold Cycle）值成正比原理，可精確定量靶標(biāo)DNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有自動化和高精度等優(yōu)點(diǎn)，但實(shí)驗(yàn)成本較高，對操作人員有技術(shù)要求，一般需要種間特異、低拷貝的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為參照。

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop mediated isothermal amplification， LAMP）是由Notomi等人于2000年建立的一種全新的鏈置換擴(kuò)增法（Strand displacement amplification， SDA）[20]。該方法針對靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下完成復(fù)雜的擴(kuò)增過程，產(chǎn)生階梯狀電泳條帶，反應(yīng)結(jié)果還可以通過擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀或特定熒光染料來判斷。LAMP法對儀器依賴度低，具有高效、靈敏、直觀的特點(diǎn)，但易出現(xiàn)假陽性，在轉(zhuǎn)基因檢測中有一定應(yīng)用[21-24]。

基于核酸的檢測方法還包括核酸印記法（Southern blot）、基因芯片法（Microarray）和生物傳感器法（Biosensor）。核酸印記雜交能夠精確區(qū)分高度同源序列，但對樣品純度要求較高，操作流程繁雜。基因芯片法能夠一次性對多種DNA序列進(jìn)行定性、定量分析，具有高通量和自動化的特點(diǎn)[25]。生物傳感器法依賴靈敏的電化學(xué)技術(shù)，通過固定在傳感器表面的特異探針與靶標(biāo)DNA結(jié)合后產(chǎn)生的電信號來檢測，是一種高靈敏度的檢測方法[26]。

此外，越來越多的新技術(shù)正不斷的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域，包括NASBA擴(kuò)增技術(shù)（Nucleic acid sequence based amplification）[27]、超分支滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（Hyper-branched rolling cycle amplification， HRCA）[28]、焦磷酸測序技術(shù)（Pyro-sequencing）[29]、高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing）[30]、毛細(xì)管電泳技術(shù)（Capillary electrophoresis， CE）[31]、高效液相色譜（High performance liquid chromatography， HPLC）[32]、近紅外光譜技術(shù)（Near infrared spectroscopy， NIS）[33]和生物條形碼技術(shù)[34]等。

1.2 針對蛋白質(zhì)的檢測技術(shù)

基于蛋白的檢測方法主要是以抗原抗體互作的免疫學(xué)理論為基礎(chǔ)，通過檢測外源基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物進(jìn)行測定，主要包括蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）、酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immuno-sorbent assay， ELISA）和側(cè)向流動免疫測定法（Lateral flow devices， LFD）[35]。

蛋白質(zhì)印跡法是檢測復(fù)雜混合物中特異蛋白的有力工具，它將電泳的高分離能力、抗體特異性和酶的高效催化結(jié)合起來，靈敏度可達(dá)1～5 ng[36]。ELISA法通過可溶性的抗原或抗體在固相載體上發(fā)生免疫反應(yīng)后，借助比色或熒光反應(yīng)鑒定目標(biāo)蛋白，檢測靈敏度通?？蛇_(dá)0.1%[37-38]。LFD法是廣泛使用的試紙條檢測法，該方法將特異抗體交聯(lián)到顯色劑和硝化纖維素試紙上，通過觀察控制線和檢測線的顏色變化來判斷檢測結(jié)果[39]。該方法樣品前處理簡便快捷，無需特殊儀器，但靈敏度較低，主要應(yīng)用于田間快檢和現(xiàn)場初篩抽查。

1.3 轉(zhuǎn)基因檢測數(shù)據(jù)庫

轉(zhuǎn)基因檢測相關(guān)數(shù)據(jù)庫主要有GMDD（GMO Detection method database）[40]、GMO Compass、CERA、BCH以及ABF等。其中GMDD數(shù)據(jù)庫整合了外源插入基因及其旁側(cè)序列、檢測方法、引物序列、協(xié)同驗(yàn)證信息、內(nèi)參基因及有證參照物質(zhì)等信息，共涉及155種商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物品系，是比較全面的轉(zhuǎn)基因檢測方法數(shù)據(jù)庫。其他數(shù)據(jù)庫主要收錄了轉(zhuǎn)基因相關(guān)的技術(shù)信息、品系特征、風(fēng)險(xiǎn)評估、產(chǎn)品標(biāo)識管理和商業(yè)化現(xiàn)狀等信息。

2 轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)現(xiàn)狀

2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定義

國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Reference material， RM）的定義是：具有一種或多種足夠均勻和很好確定了的特性值，用以校準(zhǔn)儀器設(shè)備，評價(jià)測量方法或給材料賦值的材料或物質(zhì)[41]。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為實(shí)物形式的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)，可以是純的或混合的氣體、液體或固體，穩(wěn)定性、均勻性、準(zhǔn)確性和量值溯源性是其基本屬性。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按級別一般可分為基準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Primary reference material， PRM）、有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Certified reference material， CRM）和工作級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Secondary reference material， CRM）。我國將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分為一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（國家級）和二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（部門級）[42]。

2.2 我國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的管理

我國最早的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可追溯到1952年的第一批冶金國家標(biāo)準(zhǔn)樣品，之后1988年國家標(biāo)準(zhǔn)總局批準(zhǔn)成立了全國實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)委員會，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)樣品的規(guī)范化管理；1996年，國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫局批準(zhǔn)成立了國際標(biāo)準(zhǔn)樣品委員會（ISO/REMCO）中國委員會，負(fù)責(zé)與國際接軌并根據(jù)工作需要成立了冶金、有色金屬、環(huán)保、農(nóng)藥、氣體化學(xué)品、無損探傷、酒類等7個(gè)分會及多個(gè)專業(yè)技術(shù)工作組[43]。目前，我國的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理由國家質(zhì)檢總局計(jì)量司負(fù)責(zé)，國家質(zhì)檢總局委托中國計(jì)量測試學(xué)會組織各行業(yè)專家成立全國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理委員會，制定工作導(dǎo)則與技術(shù)規(guī)范，并負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的行政審批和評審考核等工作。

2.3 轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分類

轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Reference material for GMO detection）屬于生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，是具有一種或多種足夠均勻并很好確定了相關(guān)的特性值，在轉(zhuǎn)基因檢測中用以校準(zhǔn)測量裝置、評價(jià)測量方法或給材料賦值的一種材料或物質(zhì)[44]。目前轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要有基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)兩類，其中后者又可分為質(zhì)粒DNA、基因組DNA和擴(kuò)增子DNA3種。由于不同的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度和制備工藝，不同的轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在實(shí)際應(yīng)用中各有利弊，其中基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)用范圍最廣。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是由植物種子或器官研磨加工后混合而成，主要通過重量法進(jìn)行制備。制備過程一般利用精磨手段來減小顆粒體積差異從而提高均勻性，但此過程又不可避免的會造成DNA降解，目前歐盟開發(fā)的冷凍研磨和干樣混合技術(shù)能有效地解決此問題。此外，植物特異性、組織倍性和親本特性也是影響基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性和準(zhǔn)確性的重要因素[45-46]。例如，種子的胚、胚乳和果皮的倍性不同，即各組織的DNA含量不同，若制備過程中使用的組織所占比例不同，必然會影響最終結(jié)果。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是包含待測目的基因和內(nèi)標(biāo)基因的重組質(zhì)粒分子，可作為標(biāo)準(zhǔn)陽性物質(zhì)替代物，也可根據(jù)分子量換算計(jì)算拷貝數(shù)，在定量PCR檢測中應(yīng)用廣泛[47]。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值用DNA質(zhì)量和轉(zhuǎn)化因子（Conversion factor， CF）表示，并需要通過多家實(shí)驗(yàn)室的聯(lián)合實(shí)驗(yàn)來定值。

比較而言，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備成本高，工藝復(fù)雜，而質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有廉價(jià)、易富集、使用方便和均勻性好等特點(diǎn)，尤其是在陽性物質(zhì)難以獲得的情況下，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有絕對優(yōu)勢[48]。

2.4 轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)現(xiàn)狀

目前生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的機(jī)構(gòu)主要有歐盟聯(lián)合研究中心下屬的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測量研究所（Institute for Reference Materials and Measurements， IRMM），美國的油脂化學(xué)家學(xué)會（American Oil Chemists Society， AOCS）和日本農(nóng)林水產(chǎn)省下屬的食品綜合研究所。

IRMM自1997年以來，根據(jù)歐盟標(biāo)簽制度規(guī)定的閾值，陸續(xù)研發(fā)了質(zhì)量比從0到100%不等的轉(zhuǎn)基因陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其中包括玉米、大豆、馬鈴薯、甜菜和棉花在內(nèi)的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)20余種。AOCS主要生產(chǎn)純品形式的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，包括油菜、棉花、水稻、大豆和玉米等農(nóng)作物。日本食品綜合研究所與NIPPON公司合作研發(fā)轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，但產(chǎn)品只在國內(nèi)使用，不對外銷售，目前已制備3種基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GTS40-3-2、MON810和GA21）和2類質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（大豆和玉米）。目前市場上可售的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要由IRMM和AOCS生產(chǎn)，基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)居多，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)較少。

我國轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究相對滯后，農(nóng)業(yè)部已于2011年開展重大專項(xiàng)攻關(guān)，建立了包括玉米、水稻、小麥、棉花和大豆在內(nèi)的基體、質(zhì)粒和基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制體系，并取得了階段性成果。此外，上海交通大學(xué)[49]、中國計(jì)量科學(xué)研究院[50-51]、中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院[52]等多家單位也陸續(xù)開展了轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制工作。

3 展 望

隨著世界人口增長與糧食短缺的矛盾日益加劇，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研發(fā)和應(yīng)用前景一片光明。新一代商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物性狀正趨向多樣化、復(fù)雜化，轉(zhuǎn)基因食用安全問題也正逐步成為公眾熱議的焦點(diǎn)，這使得建立快速、精準(zhǔn)、高通量的轉(zhuǎn)基因檢測體系成為必然趨勢。其中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為分析測量的物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量管理工具，其制備技術(shù)和應(yīng)用程度能夠直接反應(yīng)檢測技術(shù)體系的水平。因此，大力發(fā)展符合國情的、科學(xué)可靠的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，掌握核心技術(shù)，搶占領(lǐng)域高地，不僅關(guān)乎國家利益，而且對維護(hù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展以及保障人類健康都具有十分重要的意義。

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