自制雙管套管在大鼠前扣帶回皮層置管給藥的方法*

馮曉璞蘭坤張肖怡宋瑞瑞王銳張宇

自制雙管套管在大鼠前扣帶回皮層置管給藥的方法*

馮曉璞①蘭坤①?gòu)埿も偎稳鹑稷偻蹁J①?gòu)堄睥?/p>

目的：自制雙管套管在大鼠腦部前扣帶皮層雙側(cè)注射藥物。方法：首先自制雙管套管，在立體定位儀的指引下將雙管套管精確定位埋置并插入堵絲，然后用牙科水泥和螺釘將其固定于顱腦頂部；待大鼠術(shù)后體重恢復(fù)，將連接有微量進(jìn)樣器的注射針插入已埋置好的套管，用微量注射泵將藥物緩慢注射于兩側(cè)前扣帶皮層區(qū)域；給藥完畢后即可觀察大鼠的行為反應(yīng)；如此可反復(fù)多次給藥進(jìn)行長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)觀察。結(jié)果：藥物被準(zhǔn)確注射到目的腦區(qū)，即雙側(cè)前扣帶皮層，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠狀態(tài)良好，行為反應(yīng)如預(yù)期。結(jié)論：自制雙管套管的方法簡(jiǎn)便易行、經(jīng)濟(jì)可靠，實(shí)驗(yàn)取得良好的效果。

前扣帶回皮層； 雙管套管； 腦內(nèi)置管； 大鼠

在一些神經(jīng)生理學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)的實(shí)驗(yàn)中，觀察大腦內(nèi)雙側(cè)分布的核團(tuán)在神經(jīng)環(huán)路中的作用時(shí)，需要進(jìn)行雙側(cè)腦區(qū)同時(shí)給藥以便于研究。由于大腦神經(jīng)環(huán)路較多并且復(fù)雜，而實(shí)驗(yàn)中腦室或某一腦區(qū)局部給藥多用于觀察特定腦區(qū)或核團(tuán)在某一神經(jīng)功能活動(dòng)中的作用或研究藥物和內(nèi)源性活性物質(zhì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用[1-2]。局部埋置導(dǎo)管給藥主要有以下優(yōu)點(diǎn)：一是通過(guò)導(dǎo)管將藥物注入腦內(nèi)特定區(qū)域，可在小范圍局部干預(yù)目標(biāo)核團(tuán)或腦區(qū)的功能活動(dòng)，便于更精確探索目

標(biāo)核團(tuán)或腦區(qū)在功能活動(dòng)中起的作用；二是可以分不同時(shí)間點(diǎn)多次給藥，觀察藥物作用的時(shí)效性，掌握實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)藥物刺激的反應(yīng)；三是埋置導(dǎo)管術(shù)后5～10 d時(shí)手術(shù)應(yīng)激已消失，血腦屏障已修復(fù)，可在動(dòng)物清醒、自然狀態(tài)下觀察動(dòng)物的行為表現(xiàn)[3]。

實(shí)驗(yàn)若埋置的是單管導(dǎo)管，那么單管導(dǎo)管可以購(gòu)買(mǎi)（國(guó)內(nèi)有生產(chǎn)），也可自己制作，其方法國(guó)內(nèi)已有文獻(xiàn)[4]介紹，但有些實(shí)驗(yàn)是需要埋置雙管套管的。雙管套管?chē)?guó)內(nèi)還沒(méi)有廠家可以生產(chǎn)，若購(gòu)買(mǎi)國(guó)外的產(chǎn)品，價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)中大量使用會(huì)有較大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；若用兩個(gè)單管分別埋置，像前扣帶皮層（ACC）這樣左右對(duì)稱的腦區(qū)間隔距離又小于并排兩個(gè)單個(gè)給藥導(dǎo)管的導(dǎo)管間距，不利于準(zhǔn)確定位[5-6]。本研究室近年的工作集中于前扣帶皮層神經(jīng)元參與痛情緒反應(yīng)的相關(guān)研究，需要在動(dòng)物大腦前扣帶皮層部位給予相關(guān)受體的激動(dòng)劑或者拮抗劑[7-8]。實(shí)驗(yàn)中需要大量的雙管套管，在實(shí)驗(yàn)中，筆者結(jié)合以往的使用經(jīng)驗(yàn)，在不影響實(shí)驗(yàn)的規(guī)范性的前提下，自制了用于ACC腦區(qū)雙側(cè)給藥的雙管套管，并設(shè)計(jì)了將管道固定于立體定位儀上的裝置，提高了實(shí)驗(yàn)的效率，使實(shí)驗(yàn)成本大大降低。下面就制作方法和使用體會(huì)進(jìn)行介紹。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

1.1.1 套管系統(tǒng)

1.1.1.1 基本裝置 25 G橙色平頭針頭（也可將注射用25 G針頭加工）；注射內(nèi)芯外徑0.30 mm，可順暢插入25 G注射針頭；注射內(nèi)芯連接PE管（瑞沃德，規(guī)格型號(hào)62303），外徑0.5 mm，內(nèi)徑0.25 mm；導(dǎo)管堵頭用直徑0.2 mm或0.3 mm的304不銹鋼鋼絲做成。

1.1.1.2 雙管套管的制作 將25 G橙色針頭的塑料柄削為合適的厚度（大約0.6 mm），然后將兩個(gè)經(jīng)過(guò)處理的25 G橙色針頭用萬(wàn)能膠并排粘在一起，使兩個(gè)針頭的距離固定為1.2 mm。將不銹鋼絲裁剪約為25 mm的小段，然后彎成U形，在針頭內(nèi)插入U(xiǎn)形不銹鋼絲，將多余的堵絲剪掉，使得U型不銹鋼堵絲在針頭平面以下0.2 mm，雙針頭給藥管制作完成，見(jiàn)圖1。

圖1 自行制作實(shí)驗(yàn)用套管實(shí)物圖

1.1.1.3 套管系統(tǒng)的直徑和長(zhǎng)度選擇 筆者在側(cè)腦室所要置管的目標(biāo)位置是前扣帶皮層即Bregma向前2.6 mm，旁開(kāi)0.6 mm，深度為顱骨平面下1.6 mm[9]。此長(zhǎng)度在250～270 g重的SD大鼠剛好可以垂直達(dá)到前扣帶皮層，在250～270 g SD大鼠剛剛穿透皮層進(jìn)入前扣帶皮層，這樣就基本避免了定位偏差時(shí)相對(duì)粗大的外管對(duì)大腦的損傷。自制給藥系統(tǒng)裝置的示意圖見(jiàn)圖2。

圖2 自制給藥系統(tǒng)裝置的示意圖

1.1.1.4 套管系統(tǒng)給藥過(guò)程 裝有給藥管的套管系統(tǒng)，將連接有PE管的注射內(nèi)芯插入自制套管內(nèi)即可給藥，見(jiàn)圖3。

圖3 自制給藥系統(tǒng)裝置給藥過(guò)程示意圖

1.1.1.5 套管系統(tǒng)高溫消毒

1.1.2 其他器材 微量給藥泵；顱骨釘，直徑1.4 mm，長(zhǎng)度2.5 mm（瑞沃德，型號(hào)62512）

1.2 實(shí)驗(yàn)用品 滅菌棉球；用新潔而滅浸泡消毒過(guò)的手術(shù)器械；石蠟油；滅菌黑墨水。

1.3 手術(shù)方法 （1）雄性SD大鼠（體重250 g左右），1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（40 mg/100 g）[10]。（2）將動(dòng)物固定于立體定向儀上，齒桿前上緣低于耳桿中心3.3 mm。頭頂皮膚剃毛，消毒。（3）切開(kāi)顱頂皮膚筋膜，以無(wú)菌干棉球涂擦顱骨表面清楚暴露Bregma點(diǎn)，并用藍(lán)墨水標(biāo)記。進(jìn)針點(diǎn)定位于Bregma點(diǎn)前2.6 mm，矢狀縫兩側(cè)各0.6 mm，見(jiàn)圖4。在擬埋管及固定顱骨釘處（直徑1 mm左右）鉆孔，共鉆5孔，注意將顱骨鉆透但不要傷及腦實(shí)質(zhì)。在埋管部位鉆孔完成后可見(jiàn)清亮的腦脊液流出[4]。（4）用消毒棉球止血，干燥

術(shù)野。選用直徑為1.4 mm，長(zhǎng)度為2.5 mm的顱骨釘。將裝有堵絲的自制套管系統(tǒng)垂直固定于立體定向儀的縱向坐標(biāo)上，精確定位于Bregma點(diǎn)向前2.6 mm，旁開(kāi)0.6 mm處。將管道埋入與顱骨緊密相貼。再次干燥術(shù)野。再在術(shù)野表面滴涂石蠟油封閉并保護(hù)腦組織。之后采用牙托水泥將套管，顱骨，顱骨釘緊密粘合[3]。將粉劑和溶劑按比例混合后凝固時(shí)間為5～10 min。應(yīng)避免粘和物體表面有水，否則粘和不牢。（5）待牙托粉自凝塑料完全凝固后松開(kāi)固定管道的裝置。（6）術(shù)后腹腔注射青霉素20萬(wàn)單位/只，防止感染。（7）將大鼠放回籠，休養(yǎng)5～7 d，體重恢復(fù)后再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（8）給藥時(shí)將內(nèi)芯取出，給藥針從套管進(jìn)入給藥。給藥結(jié)束后將內(nèi)芯插入。一次給藥結(jié)束，可多次給藥。

圖4 給ACC埋置雙導(dǎo)管的平面位置示意圖

2 結(jié)果

藥物被準(zhǔn)確注射到目的腦區(qū)，即雙側(cè)前扣帶皮層，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠狀態(tài)良好，行為反應(yīng)如預(yù)期。

3 討論

在研究神經(jīng)功能活動(dòng)的環(huán)路時(shí)，需要對(duì)雙側(cè)核團(tuán)或腦區(qū)進(jìn)行同步干預(yù)。在腦立體定位儀的定標(biāo)下將帶內(nèi)芯的導(dǎo)管埋置后，用牙托水泥和小螺絲將管道的外露部分固定于顱骨表面。本實(shí)驗(yàn)自行制作設(shè)計(jì)的裝置既能夠?qū)⑺幬镒⑸淙胩囟ǖ哪康膮^(qū)域，從而圓滿完成試驗(yàn)任務(wù)，又能夠降低所花費(fèi)的費(fèi)用。埋管5～10 d后手術(shù)應(yīng)激已消失，血腦屏障已修復(fù)。此時(shí)在動(dòng)物清醒狀態(tài)下將內(nèi)芯抽出，將一連接有微量給藥泵的內(nèi)針即給藥針插入管道到達(dá)目的部位注射給藥后將內(nèi)針抽出，再插入內(nèi)芯封閉管道以再次給藥[11-13]。此法基本避免了應(yīng)激及其他因素的干擾，從而使得結(jié)果更加可信。

術(shù)后大鼠對(duì)埋置導(dǎo)管的耐受好，行為無(wú)異常。術(shù)后7 d拔出堵絲仍可見(jiàn)腦脊液流出[14]。取材時(shí)未見(jiàn)管道移位和周?chē)鲅默F(xiàn)象。需要注意的有以下幾個(gè)方面。（1）預(yù)試驗(yàn)階段曾腹腔注射10%的水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉動(dòng)物，但實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹脹率高，死亡率高。解決辦法是使用另一種麻醉劑即戊巴比妥鈉溶液腹腔注射。術(shù)前要禁食8 h，麻藥劑量要進(jìn)行精確地計(jì)算，在本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)者使用1%戊巴比妥鈉0.45 mL/100g。（2）動(dòng)物買(mǎi)來(lái)后一定要在在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)3～5 d后再手進(jìn)行手術(shù)，保持其正常的生命活動(dòng)狀態(tài)。（3）在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)1～2只行為極其癲狂的大鼠，在把實(shí)驗(yàn)大鼠斷頭處理后，觀察ACC區(qū)域，偶爾可見(jiàn)膿液存在，說(shuō)明出現(xiàn)了顱內(nèi)感染，解決辦法是術(shù)前術(shù)中用的器械必須要嚴(yán)格地進(jìn)行消毒，術(shù)后腹腔注射青霉素20萬(wàn)單位/（次·只）進(jìn)行抗炎或用青霉素粉末敷于顱腦表面亦可達(dá)到相同效果。（4）在室溫低于20 ℃的情況下，若是大鼠進(jìn)行手術(shù)，在進(jìn)行手術(shù)過(guò)程中大鼠呼吸抑制狀態(tài)不佳，甚至死亡；解決辦法是手術(shù)過(guò)程中及術(shù)后至大鼠蘇醒一定要將溫度保持在37 ℃左右，可借助電暖寶，鼠被等手段。（5）手術(shù)過(guò)程中腦立體定位儀的準(zhǔn)確性很重要，因?yàn)楣艿老鄬?duì)于大鼠的側(cè)腦室仍很粗，埋管位置與預(yù)定位置若有偏差可能會(huì)傷及腦內(nèi)組織或是其他核團(tuán)。以上實(shí)驗(yàn)過(guò)程的埋管數(shù)據(jù)是根據(jù)Paxinos和watson圖譜決定的，適用于250～270 g左右體重的SD大鼠[11]。埋管旁開(kāi)的位置為0.6 mm。（6）在手術(shù)過(guò)程中，術(shù)中用牙科鉆將標(biāo)記點(diǎn)鉆開(kāi)至硬腦膜，這個(gè)過(guò)程一定要輕慢，用針尖刺破硬腦膜至看到澄清腦脊液流出。用力不能過(guò)大，過(guò)大會(huì)損傷顱腦組織影響動(dòng)物的判斷力進(jìn)一步影響實(shí)驗(yàn)效果。（7）在見(jiàn)到稱其腦脊液流出之后下管之前要滴石蠟油封閉，因?yàn)槭炗陀袃蓚€(gè)作用，一是石蠟油可防止水分蒸發(fā)，對(duì)腦細(xì)胞有保護(hù)作用，二是石蠟油有潤(rùn)滑作用，有利于下管。（8）牙托粉將2顆螺絲和導(dǎo)管包裹固定在一起固定[11-14]。（9）因?yàn)楹藞F(tuán)區(qū)域小，藥物吸收慢，所以在給藥過(guò)程中，給藥速度一定要慢，一般控制在1 μL/5 min，注藥結(jié)束后要停留5～10 min再將注射內(nèi)芯移除，這樣有利于藥物被充分吸收[10]。（10）術(shù)后顱腦頂部裝有套管裝置的大鼠要單籠飼養(yǎng)[10]。（11）大鼠術(shù)后恢復(fù)過(guò)程中始終要給套管插上堵絲，防止腦脊液返流堵塞套管，而且還要經(jīng)常拔出堵絲保持管道通暢，便于筆者反復(fù)多次給藥。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)室成功的自行設(shè)計(jì)制作了雙側(cè)間距固定為1.6 mm的套管系統(tǒng)，恰好能夠精準(zhǔn)插入筆者試驗(yàn)的目標(biāo)腦區(qū)即前扣帶皮層，進(jìn)而注射給藥。此設(shè)計(jì)成本低，簡(jiǎn)單易操作，通過(guò)本方法，筆者可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體需求調(diào)節(jié)雙管套管之間的距離以及套管的長(zhǎng)度，以滿足不同實(shí)驗(yàn)特定腦區(qū)的給藥需求。

[1]張玉秋.痛情緒和相關(guān)記憶產(chǎn)生的神經(jīng)機(jī)制[J].自然科學(xué)進(jìn)展，2005，15（12）：1409-1415.

[2] Zhang Y，Meng X.Electroacupuncture alleviates affective pain in an inflammatory pain rat model[J].European Journal of Pain，2012，16（4）：

170-181.

[3] Zhang Y，Meng X Z.Acupuncture alleviates the affective dimension of pain in a rat model of inflammatory hyperalgesia[J].Neurochem Res，2011，36（5）：2104-2110.

[4]董榕，張敏.側(cè)腦室注射R-α-四基組胺對(duì)哮喘豚鼠呼吸道P物質(zhì)樣免疫反應(yīng)物的影響[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2003，12（2）：166-170.

[5] Cao H，Gao Y J.Activation of extracellular signal-regulated kinase in the anterior cingulate cortex xontributes to the induction and expression of affective pain[J].The Journal of Neuroscience，2009，29（10）：3307-3321.

[6] Dai R P，Li C Q.Biphasic activation of extracellular signal regulated kinase in anterior cingulate cortex distinctly regulates the development of pain-related anxiety and mechanical hypersensitivity in rats after incision[J].Anesthesiology，2011，115（45）：604-613.

[7]高永靜，趙志奇.前扣帶皮層與痛覺(jué)信息加工[J].生理科學(xué)進(jìn)展，2003，34（4）：293-297.

[8]任文華.大鼠前扣帶皮層吻側(cè)部NMDA受體在痛厭惡情緒形成中的作用[D].上海：復(fù)旦大學(xué)，2007.

[9] Zhang L，Zhang Y Q.Anterior cingulate cortex contributes to the descending facilitatory modulation of pain via dorsal reticular nucleus[J].European Journal of Neuroscience，2005，22（14）：1141-1148.

[10] Gao Y J，Ren W H.Contributions of the anterior cingulate cortex and amygdala to pain-and fear-conditioned place avoidance in rats[J]. Pain，2004，110（15）：343-353.

[11] Paxinos G，Watson C.The rat brain in stereotaxic coordinates[M].Six edition.New York：Carlifomia Aeademic Press，2007：48-124.

[12] Joshua P，Johansen K，Howard L，et al.The affective component of pain in rodents： direct evidence for a contribution of the anterior cingulate cortex[J].PNAS，2001，98（14）：8077-8082.

[13]于海明，王百忍.大鼠側(cè)腦室置管方法的改良[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志， 2005，20（2）：207-211.

[14]靳艷卿，段世明.側(cè)腦室注射河豚毒素和藜蘆定對(duì)大鼠異氟醚MAC的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志，2000，20（5）：305-307.

The Cannulation and Administration Techniques with Home-made Double Cannula in the Anterior Cingulate Cortex in Rats

/FENG Xiao-pu， LAN K un，ZHANG Xiao-yi，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（18）：042-045

Objective：To catheter and administrate in bilateral anterior cingulate cortex （ACC） with homemade double cannula in rats in our experiment.Method：Firstly the double cannulas were made by ourselves， then under the guidance of the stereotaxic instrument， a double cannula was implanted in ACC region on the top of rats’skull， and was fixed with denture base resins and bolts. When the body weight of rats returned to normal after surgery， the needle connecting with the micro-injector was inserted into cannula， then the reagent was slowly pushed into ACC region by syringe pump. After the administration was finished， behavioral test could be started. Used this technique， local application of reagent in brain region might be repeated for many times. Result：The reagent was injected accurately into the bilateral ACC region. And during the experiment， the behavioral responses of rats were as desired. Conclusion：Home-made double cannula get a good effect in the experiment. The making process is simple， economic and reliable.

Anterior cingulate cortex ； Double cannula； Implanted tube； Rats

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.014

2014-04-21） （本文編輯：蔡元元）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81371254）

①山西醫(yī)科大學(xué) 山西 太原 030001

張宇

First-author’s address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China