炮制對梔子中綠原酸含量的影響

楊海玲， 宋永龍， 吳尤嬌

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530001；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港 222002)

梔子(FRUCTUS GARDENIAE)為茜草科(Rubiaceae)植物梔子(GardeniajasminoidesEills)的干燥成熟果實(shí)，具有瀉火除煩、清熱利尿和涼血解毒之功效，可用于治療熱病心煩、黃疸尿赤、血淋澀痛和目赤腫痛等[1]。梔子為臨床常用藥，常用有炒黃、炒焦、炒炭幾種炮制品[2]。據(jù)文獻(xiàn)報道，梔子主要含有環(huán)烯醚萜苷、有機(jī)酸和色素3類有效成分，其中綠原酸為有機(jī)酸主要成分之一[3-4]?，F(xiàn)代藥理試驗證明，綠原酸具有抗肝損傷[5]、抑菌[6]、抗病毒[7]、利膽[7]和促進(jìn)胃液分泌[7]等廣泛作用。筆者利用HPLC法測定梔子及炮制品中綠原酸的含量，旨在為綜合評價和分析梔子及其不同炮制品的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。梔子，購自玉林藥材市場，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為茜草科植物梔子(GardeniaJasminoidesEllis)的干燥成熟果實(shí)。

1.1.2主要儀器。LC-1100AT高效液相色譜分析儀，購自安捷倫公司，包括紫外檢測器；KQ-250B型超聲波清洗器，購自昆山市超聲儀器有限公司。

1.1.3主要試劑。綠原酸對照品，購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110742-200517。甲醇(色譜純)，購自天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司，批號：091230102；乙腈(色譜純)，購自Fisher lawn，批號：08412;娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純，市售。

1.2方法

1.2.1梔子飲片的炮制。①生品。取中等大小梔子藥材(完整個藥，11.4 mm≤D≤13.4 mm)若干，撿取雜質(zhì)霉敗品，即得。②炒焦(輕)品。取梔子生品(中)置預(yù)熱的電炒鍋中，中火(1 500 W，200 ℃)加熱6 min，炒至焦黃色(偶見焦斑)，即得。③炒焦品。取梔子生品(中)，置預(yù)熱的電炒鍋中，中火(1 500 W，200 ℃)加熱7 min，炒至焦黃色(帶焦斑)即得。④炒焦(重)。梔子生品(中)，置預(yù)熱的電炒鍋中，中火(1 500 W，200 ℃)加熱9 min，炒至焦黃色(略帶黑斑)即得。⑤炒炭品。取生梔子(個藥)，置預(yù)熱的電炒鍋中，武火(2 100 W)加熱11 min，炒至黑褐色，即得。

1.2.2色譜條件。色譜柱為Inertsil ODS-2C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-濃度0.1%冰醋酸(12∶88，V/V)；流速為1 ml/min，柱溫為25 ℃，檢測波長327 nm，分析時間25 min，進(jìn)樣體積20 μl。

1.2.3對照品溶液的制備。精密稱取 2.10 mg綠原酸對照品，置于10 ml量瓶中，加無水甲醇溶解，并用無水甲醇稀釋至刻度，即得(濃度為0.21 mg/ml)。

1.2.4供試品溶液的制備。分別精密稱取生梔子、炒黃、炒焦(輕)、炒焦品、炒焦(重)、炒炭各樣品粉末(過60目篩)2.000 g，置于250 ml具塞錐形瓶中，精密加入石油醚(60～90 ℃)100 ml，回流30 min脫脂，濾過；濾渣精密加入無水甲醇20 ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，取出放冷后再稱定重量，用無水甲醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，濾過；精密取續(xù)濾液10.0 ml，蒸干，殘渣用水5 ml溶解，用0.5 mol/ml的鹽酸溶液調(diào)pH 2～3；乙酸乙酯萃取2次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣用無水甲醇溶解，并定容至10 ml量瓶中，搖勻，精密取續(xù)濾液適量，于離心機(jī)中( 10 000 r/min)離心，取上清液即得。

1.2.5方法學(xué)考察。(1)系統(tǒng)適應(yīng)性試驗。分別取對照品溶液和供試品溶液適量，在“1.2.2”色譜條件下進(jìn)行測定，繪制色譜圖，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。(2)線性關(guān)系的考察。分別精密吸取綠原酸對照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、12.0和16.0 μl，按“1.2.2”色譜條件測定峰面積，以峰面積Y(mAU)對應(yīng)綠原酸對照品進(jìn)樣量X(μg/μl)進(jìn)行線性回歸，計算線性回歸方程。(3)精密度試驗。精密吸取綠原酸對照品溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算峰面積的RSD。(4)重復(fù)性試驗。取炒焦(重)樣品5份，按“1.2.3”項下的制備方法制備，測定，計算峰面積的RSD。(5)穩(wěn)定性試驗。精密吸取炒焦(重)供試品溶液10 μl，分別在0、2、4、6、8和12 h進(jìn)樣，計算峰面積的RSD。(6)加樣回收率試驗。取已知含量的炒焦(重)粉末6份，精密稱定1.000 g，分別加入熊果酸對照品1.40 mg。依“1.2.3”項下的制備方法制備并測定，計算平均回收率和RSD。

1.2.6樣品的含量測定。按“1.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別吸取各樣品溶液10 μl，依法進(jìn)樣進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1方法學(xué)考察(1)系統(tǒng)適應(yīng)性試驗。圖1表明，在相同的時間上，各供試品溶液和對照品溶液在對應(yīng)的位置有相同的吸收峰，且綠原酸得到較好的分離，相鄰峰間分離度均大于1.5，計算理論塔板數(shù)不低于10 000，表明系統(tǒng)適應(yīng)性良好。(2)線性關(guān)系的考察。計算得線性回歸方程為：Y=1 687.2X+331.06，R=0.999 9 (n=6)。試驗結(jié)果表明，在0.42～2.52 μg/μl范圍內(nèi)，綠原酸濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。(3)精密度試驗。計算得峰面積的RSD為1.94%，表明該儀器精密度良好。(4)重復(fù)性試驗。計算得峰面積的RSD為1.59%，表明該方法重復(fù)性良好。(5)穩(wěn)定性試驗。計算得峰面積的RSD為1.70%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。(6)加樣回收率試驗。由表1可知，平均回收率為100.83%，RSD為1.30%，表明該方法簡便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性良好，可用于控制梔子不同炮制品的質(zhì)量。

注：A為綠原酸對照品；B為生梔子；C為炒黃品；D為炒焦品(輕)；E為炒焦品；F為炒焦品(重)；G為炒炭品；1為綠原酸。圖1 綠原酸及梔子各樣品HPLC圖譜

表1 綠原酸加樣回收率試驗

注：加入綠原酸對照品均為1.40 mg。

2.2梔子炒焦前后綠原酸的含量測定由表2可知，生梔子、炒黃品、炒焦品(輕)、炒焦品、炒焦品(重)和炒炭品中綠原酸的含量分別為1.51%、1.34%、1.38%、1.36%、1.18%和1.04%，RSD分別為1.65%、2.01%、2.94%、2.41%、1.52%和2.59%。其中，生梔子中綠原酸的含量最高，炒炭品的含量最低。

表2 梔子炒焦前后綠原酸的含量測定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論與討論

試驗采用HPLC 法對中等大小的生梔子(個藥)及不同炮制程度的梔子樣品進(jìn)行了比較研究，測定有機(jī)酸類成分綠原酸含量。結(jié)果表明，試驗各樣品中綠原酸含量較學(xué)者報道的高[8]，究其原因可能是試驗所用梔子藥材產(chǎn)自廣西，質(zhì)量較優(yōu)，這也再次證明廣西山梔子的道地性及優(yōu)越性。對結(jié)果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，梔子經(jīng)炮制后綠原酸含量均降低，且隨著炒制時間的延長與炒制程度的加重，綠原酸含量降低越明顯。梔子經(jīng)炮制后，綠原酸含量與生品比較，炒炭品下降最多(31.1%)，其次分別是炒焦品(重，21.85%)、炒黃品(11.30%)、炒焦品(9.93%)，而炒焦(輕)下降最少(8.61%)。生品中綠原酸含量最高，可能由于生品未經(jīng)加熱處理，避免了綠原酸的損失；而各炒制品中以炒焦(輕，1.38%)含量略高于炒焦(1.36%)，可能是炒焦品炒制時間相對較短，減少了樣品中含綠原酸的損失；炒黃品低于炒焦品，可能是由于炒黃炒制溫度較低，其樣品中含水量較高，從而導(dǎo)致其含量降低；其次是炒焦品(重，1.18%)；炒炭品含量最低，可能與綠原酸熔點(diǎn)較低、受熱不穩(wěn)定理化性質(zhì)有關(guān)。由此可見，加熱炮制對綠原酸含量有明顯影響。臨床應(yīng)用時因根據(jù)需要選用適當(dāng)?shù)呐谥破贰?/p>

試驗對無水甲醇、純化水、濃度0.1%磷酸等不同流動相組成體系進(jìn)行比較，結(jié)果或是出現(xiàn)基線漂移或是色譜峰拖尾等現(xiàn)象，分離效果均不好。故試驗采用乙腈-濃度0.1%冰醋酸(12∶88，V/V)為流動相，可使綠原酸在較短時間內(nèi)(約 14.1 min)出峰，而且峰分離良好、基線平穩(wěn)。該方法分離效能高、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可有效地控制梔子藥材及其飲片的質(zhì)量。研究結(jié)果為合理規(guī)范炮制工藝參數(shù)、優(yōu)化飲片炮制工藝、探討梔子的炮制意義及制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典：一部[S]．北京：中國醫(yī)藥科學(xué)出版社，2010:231.

[2] 龔千鋒．中藥炮制學(xué)[M]．北京:中國中醫(yī)藥出版社，2008:111．

[3] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會. 中國植物志[M]. 北京:科學(xué)出版社，1990.

[4] 于洋，高昊， 戴毅,等．梔子屬植物化學(xué)成分的研究進(jìn)展[J]．中草藥，2010，41(1):148-153.

[5] 史秀玲,高銀輝．綠原酸對小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].中國實(shí)驗方劑學(xué)雜志，2011，17(19)：199-202.

[6] 張澤生,烏蘭.金銀花中綠原酸的體外抑菌和抗氧化性的研究[J].天津科技大學(xué)學(xué)報,2005,20(2):5-8,34.

[7] 鄧良，袁華，喻宗沉．綠原酸的研究進(jìn)展[J]. 化學(xué)與生物工程，2005，22(7):4-6.

[8] 黎潭輝,羅淑芳,莊義修. HP LC法測定江西梔子中綠原酸的含量[J]. 中醫(yī)臨床研究,2012,4(7):50-51.