貽貝煮汁液酶解工藝的研究

羅偉，段振華，2，*，萬斌，胡靜

（1.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228；2.海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?70228）

貽貝煮汁液酶解工藝的研究

羅偉1，段振華1，2，*，萬斌1，胡靜1

（1.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228；2.海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?70228）

研究酶法水解貽貝煮汁液的工藝，以水解度和苦味分為指標(biāo)，比較了1.398中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶水解貽貝煮汁液的效果，發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶效果最好。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以氨基酸態(tài)氮含量為響應(yīng)值，通過Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法對(duì)影響煮汁液水解的主要因素進(jìn)行工藝優(yōu)化，確定貽貝煮汁液酶解最佳條件為：料水比1∶1.5（g/mL）、酶添加量0.76%、溫度50.46℃、pH6.47、時(shí)間4 h，該條件下酶解液中氨基酸態(tài)氮含量為283.30mg/100mL。

貽貝煮汁；水解；木瓜蛋白酶；氨基酸態(tài)氮

貽貝俗稱“海紅”、“殼菜”、“淡菜”，是我國重要的養(yǎng)殖貝類之一[1]。貽貝肉鮮美可口，營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)，是一種集營養(yǎng)、保健、防病于一體的海產(chǎn)品，具有很高的食療與藥用功效。但在貽貝工業(yè)化加工過程中，經(jīng)蒸煮預(yù)處理產(chǎn)生的汁液常常被作為廢棄液排放，既污染環(huán)境，又浪費(fèi)資源。貽貝蒸煮廢棄液富含貽貝水溶性營養(yǎng)成分及生物活性物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)主要研究貽貝煮汁液的酶法水解，旨在為酶技術(shù)應(yīng)用于貽貝廢棄液深加工生產(chǎn)高附加值的商品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貽貝煮汁液：海南椰島（集團(tuán)）股份有限公司提供；1.398中性蛋白酶（5×104U/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（1.5×105U/g）：廣西杰沃利生物制品有限公司；胰蛋白酶：ICN公司；復(fù)合蛋白酶（3.8× 105U/g）：丹麥Novo公司。

氫氧化鈉、鹽酸、濃硫酸、硼酸、硫酸鉀、硫酸銅、酚酞、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、亞甲基藍(lán)指示劑、95%乙醇、甲醛等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S26S電熱恒溫水浴鍋：金壇市大地自動(dòng)化儀器廠；101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱：常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；85-1恒溫磁力攪拌器：金壇市富華儀器有限公司；BS124S電子天平：德國Sartorius公司；PHS-3C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：上海偉業(yè)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 總氮量及氨基酸態(tài)氮測(cè)定

總氮量測(cè)定：參照GB5009.5—2010凱氏定氮法；氨基酸態(tài)氮測(cè)定：采用甲醛電位滴定法[2-3]。

1.3.2 水解度[4-5]

1.3.3 苦味評(píng)價(jià)

參照文獻(xiàn)[6-8]方法。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考酶的選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定木瓜蛋白酶繼續(xù)試驗(yàn)，以氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)為：加酶量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）、酶解溫度（40、45、50、55、60℃）、酶解時(shí)間（2、3、4、5、6 h）、pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、料水比g/mL（1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3）。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法（RSA）優(yōu)化酶解工藝參數(shù)。其因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table1 Factors and levels of the response surface tests

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的選擇試驗(yàn)結(jié)果

為了比較1.398中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶水解貽貝煮汁液的效果，以水解度和苦味值為指標(biāo)，料水比（煮汁液與去離子水體積比）為1∶2（g/mL），酶的添加量為0.4%，在各酶最適作用條件下水解4 h，其最適作用條件根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]和初步試驗(yàn)確定，加熱滅酶10min，4 000 r/min離心15min，取上清液分別進(jìn)行水解度和苦味測(cè)定（用于苦味評(píng)定的上清液必須滅菌后進(jìn)行品評(píng)）結(jié)果見表2。

表2 不同蛋白酶對(duì)貽貝煮汁液水解的影響Table2 Hydrolysis influence of different proteases

由表2可見，選用木瓜蛋白酶水解貽貝煮汁液時(shí)，蛋白質(zhì)水解程度高于其他3種酶，且苦味分也較低。因此，決定采用該酶進(jìn)一步試驗(yàn)。

2.2 木瓜蛋白酶的單因素試驗(yàn)

2.2.1 酶用量的選擇

在溫度為50℃，酶解時(shí)間為4 h，pH6.5，料水比為1∶2（g/mL）的條件下，加酶量不同，測(cè)得氨基酸態(tài)氮含量有所差別，見圖1。

圖1 加酶量對(duì)氨基酸態(tài)氮的影響Fig.1 The effect of amount of enzyme on amino acid-nitrogen（AA-N）

由圖1可看出，當(dāng)加酶量超過0.7%時(shí)，氨基態(tài)氮含量基本無明顯升高。此結(jié)果可解釋為酶用量在0.7%以下時(shí)，底物能被酶作用的位點(diǎn)過量，氨基態(tài)氮含量隨酶用量的增加而逐漸升高；然而，當(dāng)加酶量超過0.7%時(shí)，由于酶濃度已逐漸為底物所飽和的原因，導(dǎo)致氨基態(tài)氮含量隨加酶量的增加而升高很小[11-12]。所以考慮成本等因素，木瓜蛋白酶添加量取0.7%為宜。

2.2.2 酶解溫度的選擇

在酶的添加量取0.7%，酶解時(shí)間為4 h，pH6.5，料水比為1∶2（g/mL）的條件下進(jìn)行不同溫度的選擇，其水解效果不同，見圖2。

圖2 溫度對(duì)氨基酸態(tài)氮的影響Fig.2 The effect of temperature on amino acid-nitrogen（AA-N）

由圖2可看出，隨著溫度的升高氨基態(tài)氮含量呈先升后降的趨勢(shì)，在50℃時(shí)氨基態(tài)氮含量達(dá)到最大值。因此，木瓜蛋白酶的酶解最適溫度在50℃左右為宜。

2.2.3 酶解時(shí)間的選擇

在酶加量為0.7%，酶解溫度為50℃，pH6.5，料水比為1∶2（g/mL）的條件下，分別選擇2、3、4、5、6 h進(jìn)行酶解，見圖3。

由圖3可看出，在初期的1 h內(nèi)酶解反應(yīng)迅速，當(dāng)水解進(jìn)行3 h左右氨基態(tài)氮含量達(dá)到最大值；5 h后達(dá)到水解平衡，氨基態(tài)氮含量基本無明顯變化。所以本研究選擇水解時(shí)間為3 h。

圖3 時(shí)間對(duì)氨基酸態(tài)氮的影響Fig.3 The effect of time on amino acid-nitrogen（AA-N）

2.2.4 酶解pH的選擇

在酶加量為0.7%，酶解溫度為50℃，時(shí)間為3 h，料水比為1∶2（g/mL）的條件下，分別將pH調(diào)節(jié)為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，測(cè)得氨基酸態(tài)氮含量的變化，見圖4。

圖4 pH對(duì)氨基酸態(tài)氮的影響Fig.4 The effect of pH on amino acid-nitrogen（AA-N）

圖4表明，隨著酶解pH的遞增，氨基態(tài)氮含量呈先增后降的趨勢(shì)，當(dāng)pH達(dá)到6.5左右時(shí)，酶解液中氨基態(tài)氮含量達(dá)到最大值，這是因?yàn)閜H會(huì)直接影響酶及蛋白質(zhì)分子的某些解離基團(tuán)的解離狀態(tài)。只有在特定pH條件下，酶及底物蛋白質(zhì)的解離基團(tuán)才能處于易于結(jié)合并轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的解離狀態(tài)[8]。

2.2.5 料水比的選擇

在酶加量為0.7%，酶解溫度為50℃，時(shí)間為3 h，pH6.5的條件下，觀察不同料水比對(duì)酶解效果的影響，見圖5。

圖5 料水比對(duì)氨基酸態(tài)氮的影響Fig.5 The effect of the raw material water on amino acid-nitrogen（AA-N）

由圖5可知，當(dāng)料水比為1∶1.5（g/mL）時(shí)酶解液中氨基態(tài)氮含量最高，1∶2時(shí)其含量略低，超過1∶2時(shí)氨基態(tài)氮含量下降較多。其主要原因可能為：酶解體系中加入適量的水，使底物在溶液狀態(tài)下有效地與酶結(jié)合，從而產(chǎn)生更多氨基態(tài)氮；但底物濃度過小時(shí)，導(dǎo)致酶濃度降低，氨基態(tài)氮含量會(huì)下降，不利于反應(yīng)進(jìn)行。而且在生產(chǎn)上也不利于酶解液后期的濃縮等工藝要求[13]。所以綜合考慮，選擇料水比為1∶1.5（g/mL）進(jìn)行研究。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table3 Designs and results of Box-Benhnken experimental（n=5）

方差分析及顯著性比較結(jié)果見表4。

利用Design-expert7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，對(duì)各因素回歸擬合，得到氨基態(tài)氮含量Y的回歸方程Y=285.74+1.23X1-0.17X2+0.88X3-2.27X4-1.23X1X2+ 2.10X1X3-0.35X1X4+1.58X2X3-1.23X2X4+2.10X3X4-2.93X12-4.33X22+0.047 X32-4.68X42。同時(shí)，優(yōu)化4個(gè)影響因素的最佳組合為：加酶量0.76%，酶解溫度50.46℃，酶解時(shí)間4 h，pH為6.47，預(yù)測(cè)的氨基酸態(tài)氮含量為287.65mg/100mL。

表4 氨基酸態(tài)氮含量回歸模型方差分析表Table4 Variance analysis of regression equation

由表4可以看出，所得Y的回歸方程極顯著，且失擬項(xiàng)不顯著，說明此模型很理想，用方程Y擬合4個(gè)因素與氨基酸態(tài)氮含量是可行的。相關(guān)系數(shù)R2=0.989 6，表明回歸方程與實(shí)際數(shù)據(jù)間具有較好的擬合性；R2Adj= 0.979 3，說明可信度較高。從因素X1、X2、X3、X4對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響來看，除方程的一次項(xiàng)X2及二次項(xiàng)X32影響不顯著外，其余因素影響均為極顯著。通過比較方程一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值大小，可以判斷因素影響的主次性[14]，本實(shí)驗(yàn)中因素間影響順序依次為X4＞X1＞X3＞X2；交互項(xiàng)中除X1X4影響不顯著外，其余因素間交互作用對(duì)氨基酸態(tài)氮含量均達(dá)到極顯著（P＜0.01）影響，且各具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是呈二次關(guān)系。

分別將模型中X1、X2、X3及X4其中2個(gè)因素固定在0水平，得到另外2個(gè)因素間交互作用對(duì)氨基酸態(tài)氮含量Y的子模型，圖6～圖9為4個(gè)因素間部分兩兩交互作用對(duì)氨基酸態(tài)氮含量影響的響應(yīng)面分析圖。

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在最佳酶解條件：加酶量為0.76%，溫度50.46℃，時(shí)間4 h，pH為6.47時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得氨基態(tài)氮含量為283.30mg/100mL，與預(yù)測(cè)值基本接近，表明預(yù)測(cè)值和真實(shí)值間有較好的擬合性，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的可靠性。

圖6 加酶量和溫度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.6 The effect amount of enzyme and temperature on amino acid-nitrogen

圖7 加酶量和時(shí)間對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.7 The effect amount of enzyme and times on amino acidnitrogen

圖8 加酶量和pH對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.8 The effect amount of enzyme and pH on amino acidnitrogen

圖9 溫度和pH對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.9 The effect temperature and pH on amino acid-nitrogen

3 結(jié)論

以貽貝煮汁液為原料，綜合比較了1.398中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶酶解液的水解度和苦味評(píng)分，選擇木瓜蛋白酶為目標(biāo)用酶。在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析，建立了氨基酸態(tài)氮含量與加酶量、溫度、時(shí)間、pH的二次多項(xiàng)回歸模型，其各因素的主要效應(yīng)關(guān)系為：X4（pH）＞X1（加酶量）＞X3（時(shí)間）＞X2（溫度），并確定了最佳酶解條件：酶添加量0.76%、溫度50.46℃、pH6.47、時(shí)間4 h，此工藝條件下測(cè)得平均氨基酸態(tài)氮含量為283.30mg/100mL，其與理論值間相對(duì)誤差為1.51%。

[1]段偉文,羅偉,段振華,等.貽貝的加工利用研究進(jìn)展[J].漁業(yè)現(xiàn)代化,2013,40(3):51-55

[2]張水華.食品分析實(shí)驗(yàn)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006:47-49

[3]寧正祥.食品成分分析手冊(cè)[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1998: 22-23

[4]趙新淮,馮志彪.蛋白質(zhì)水解物水解度的測(cè)定[J].食品科學(xué),1994: 15(11):65-67

[5]Nielsen PM,Petersen D,Dambmann C.Improved method for determining food protein degree of hydrolysis[J].Journal of Food Science, 2001,66(5):642-646

[6]段振華,張慜,郝建,等.酶法水解鳙魚下腳料及其降苦機(jī)理研究[J].食品工業(yè)科技,2003:24(5):19-22

[7]Hou X J,Chen W.Optimization of extraction process of crude polysaccharides from wild edible Bachu mushroom by response surface methodology[J].Carbohydrate Polymers,2007,7:34-41

[8]呂振磊,劉朝龍,王雨生,等.響應(yīng)面法優(yōu)化紫貽貝蛋白酶解工藝條件[J].食品科學(xué),2012,33(10):61-65

[9]馬佳卉.貽貝蛋白酶解制備活性肽的工藝研究及活性評(píng)價(jià)[D].浙江海洋學(xué)院,2012

[10]Duan ZH,Wang J L,Yi M H,et al.Recovery of Proteins from Silver carp By-products with Enzymatic Hydrolysis and Reduction of Bitterness in Hydrolysate[J].Journal of Food Process Engineering,2010, 33(5):962-978

[11]馮金曉,薛長湖,徐瑩,等.響應(yīng)面法優(yōu)化ProteaseM酶解牡蠣工藝的研究[J].食品科技,2009,34(5):184-188

[12]朱志偉,曾慶孝,吳小勇.翡翠貽貝的酶法水解工藝研究[J].食品工業(yè)科技,2002(10):42-44

[13]楊萍,夏永軍,范偉群.木瓜蛋白酶對(duì)羅非魚下腳料的水解作用[J].水產(chǎn)科學(xué),2008,27(6):290-292

[14]周存山,馬海樂,胡文彬.條斑紫菜多糖提取工藝的優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2006,22(9):194-197

Study on Enzymatic Hydrolysis Technology of Mussel Boiled Liquor

LUO Wei1，DUAN Zhen-hua1，2，*，WAN Bin1，HU Jing1
（1.College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China；2.Key Laboratory of Tropical Biological Resources，Ministry of Education，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

Enzymatic hydrolysis of mussel boiled liquor was studied in this paper.Firstly，the effects of various enzymatic treatments with neutral protease，papain，trypsin and protamex on bitter taste value and degree of hydrolysis were compared，and the papain was found to be the best.Based on the result of single-factor tests，the amino acid-nitrogen content was chosen as the response values，then Box-Benhnken experimental design and response surface method were used to optimize technological conditions which is as follows：the material-to-water ratio1∶1.5（g/mL），enzyme addition amount of 0.76%，hydrolysis temperature of 50.46℃，hydrolysis pH of 6.47，hydrolysis time of 4h.Under such conditions，the content of amino acid-nitrogen reached283.30mg/100mL.

mussel boiled liquor；hydrolysis；papain；amino acid-nitrogen

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.011

2013-09-23

國家“十二五”科技支撐計(jì)劃（2013BAB01B04）；海南省科技興海專項(xiàng)（XH201308）

羅偉（1989—），男（漢），碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品食品科學(xué)技術(shù)。

*通信作者：段振華（1965—），男（漢），教授，博士，碩導(dǎo)，研究方向：水產(chǎn)食品科學(xué)技術(shù)。