IL-22和SOCS3在3型鼠肝炎病毒誘導的小鼠慢性病毒性肝炎發(fā)病中的作用探討*

李詠，陸玉蕾，吳婷，韓梅芳，寧琴

·實驗性肝炎·

IL-22和SOCS3在3型鼠肝炎病毒誘導的小鼠慢性病毒性肝炎發(fā)病中的作用探討*

李詠，陸玉蕾，吳婷，韓梅芳，寧琴

目的探討鼠3型肝炎病毒（MHV-3）誘導的慢性病毒性肝炎C3H/Hej小鼠肝組織白細胞介素-22（IL-22）和細胞因子信號抑制因子3（SOCS3）mRNA水平的變化。方法給C3H/Hej小鼠腹腔注射MHV-3（100 pfu），誘導慢性病毒性肝炎模型，采用實時熒光定量PCR法檢測MHV-3感染后0、5、10、15和20 d時小鼠肝組織IL-22和SOCS3 mRNA水平的變化。結果模型鼠肝組織IL-22和SOC3 mRNA水平在0 d時分別為（0.26± 0.15）%和（6.35±2.21）%，在感染后10、15和20 d后IL-22水平分別為（6.28±2.79）%、（2.50±1.24）%和（2.73± 0.85）%，SOC3水平分別為（16.92±4.39）%、（14.06±4.09）%和（13.36±1.89）%，均較0 d時顯著增高（P＜0.05），且在第10 d達到最高峰。結論IL-22和SOCS3可能參與了MHV-3誘導的小鼠慢性病毒性肝炎的發(fā)生發(fā)展過程。

鼠3型肝炎病毒；慢性病毒性肝炎；白細胞介素-22；細胞因子信號抑制因子3；小鼠

白細胞介素-22（interleukin-22，IL-22）是IL-10細胞因子家族的一個成員，參與機體早期免疫防御，保護并修復炎癥反應造成的組織損傷[1]。IL-22可以由自然殺傷細胞22（NK22）和輔助性T淋巴細胞17/22（Th17/22）等細胞產生[2]。這些細胞需要對T細胞受體（TCR α/β）或外來細胞因子的刺激產生應答才能產生IL-22。例如白細胞介素-9（IL-9）的刺激就可以促進相關細胞分泌IL-22。在感染過程中，IL-22的產生與蛋白酪氨酸激酶家族（JAK1），酪氨酸激酶2（TYK2）信號通路激活有關。在這一過程中，JAK1和TYK2首先被磷酸化，信號轉導因子和轉錄激活因子3（STAT3）和信號轉導因子和轉錄激活因子1（STAT1）被激活，磷酸化的STAT1和STAT3入核，誘導特定基因的表達[4]。IL-22行使其功能主要通過與受體結合，并被運送至靶細胞而發(fā)揮作用，同時IL-22可以通過協(xié)同效應作用于IL-17，以共同調節(jié)天然免疫相關分子的表達[3]。有研究表明IL-22在消化道、皮膚和呼吸系統(tǒng)的黏膜固有免疫中起重要作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)IL-22在銀屑病、異位性皮炎以及潰瘍性結腸炎等患者外周血中高表達;與之相反，在急性呼吸窘迫綜合征和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者，血清IL-22水平是下降的。上述這些研究說明IL-22的表達與炎性疾病可能存在一定的關聯(lián)[1，4]。IL-22的產生需要STAT3的活化，同時由于負反饋通路的存在，細胞因子信號傳導抑制分子3（SOCS3）也會出現(xiàn)上調。SOCS3具有負性調節(jié)細胞因子信號轉導的作用[5]，SOCS3可被多種炎癥因子和抗炎因子誘導，這其中就包括IL-22。SOCS3激活后可抑制多種免疫分子的信號傳導。在小鼠的相關研究表明，SOCS3也與炎癥相關疾?。ㄏ㈥P節(jié)炎、炎癥性腸病[6～10]）等密切相關。SOCS3是調節(jié)細胞信號轉導網絡的關鍵蛋白。因此，SOCS3水平異常時可能預示著炎癥疾病的發(fā)生和發(fā)展。

有研究表明，IL-22和SOCS3在炎癥性疾病的發(fā)展過程中可以相互調節(jié)[9]，兩者間的相互作用在炎癥和組織損傷修復中起到重要作用。目前，關于IL-22和SOCS3在慢性肝損傷中的水平變化及作用的研究還比較少。本研究利用鼠三型肝炎病毒（MHV-3）誘導的小鼠慢性肝損傷模型，研究IL-22和SOCS3的變化情況，以探討兩者在慢性肝損傷發(fā)病機制中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 病毒株MHV-3病毒株為本研究室保存，注射用MHV-3滴度為1×106pfu/ml。

1.2 慢性肝損傷模型的建立取雌性SPF級C3H/ Hej小鼠（上海實驗動物中心），6～8周齡，體質量18～20 g，飼養(yǎng)在本實驗室潔凈層柜（IVC系統(tǒng)，蘇州蘇杭科技有限公司）內，恒溫、恒濕，自由食水。隨機將小鼠分為模型組和對照組，各25只。模型組小鼠腹腔注射含10 pfu MHV-3的生理鹽水溶液200 μl，對照組小鼠腹腔注射PBS液200 μl。在注射前（0 d）和注射后第5、10、15、20 d分批收集小鼠肝組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色。

1.3 肝組織IL-22和SOCS3 mRNA檢測取肝組織30～50 mg，溶解于Trizol 1 ml中，進行碾磨，采用Trizol法提取總RNA。取總RNA 1 μg，逆轉錄成cDNA。采用南京金斯瑞公司提供的試劑盒行逆轉錄，加入Oligod T 1μl，雙蒸水補足至12 μl，70℃水浴10 min，冰上冷卻，再依次加入：逆轉錄混合緩沖液4 μl，1 mmol/L dNTP 1 μl，RNA酶抑制劑2 μl，37℃水浴5 min，加入逆轉錄酶1 μl，42℃水浴60 min，70℃滅活10 min，終止反應，將cDNA置于-20℃保存。引物序列如下:鼠GAPDH上游序列：5’-CTCATGACCACAGTCCATGCCATC-3’，下游序列: 5'-CTGCTTCACCACCTTCTTG-3’；鼠IL-22上游序列: 5’-TTGAAATGTCCAATTCCAGCA-3’，下游序列:5’-GCCGGACGTCTGTGTTGTTA-3’；鼠SOCS3上游序列:5’-GCTGGCCAAAGAAATAACCA-3’，下游序列：5’-AGCTCACCAGCCTCATCTGT-3’。PCR反應體系為20 μl，包括上下游引物各1 μl，模板1 μl，SYB 10 μl，加雙蒸水補足至20 μl。反應條件為95℃1 min，95℃15 s，60℃15 s，72℃35 s，40個循環(huán)。使用日本TOYOBO公司提供的RealTimePCR試劑（QPK201-T），在Applied Bio-systems 7500（ABI美國）儀器上進行目的基因檢測。

1.4 統(tǒng)計學分析應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，計量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 慢性病毒性肝炎小鼠模型建立成功小鼠在感染病毒10 d后，肝組織有大量的淋巴細胞和少量的中性粒細胞浸潤，肝小葉結構明顯破壞，出現(xiàn)肝細胞水腫、氣球樣變、點狀壞死或灶狀壞死，甚至碎片樣壞死（圖1）。

圖1 感染MHV-3小鼠肝組織病理學表現(xiàn)（HE，200×）

2.2 肝組織IL-22 mRNA水平變化在MHV-3誘導的C3H/Hej小鼠慢性肝損傷模型中，隨著感染時間的延長，小鼠肝組織IL-22 mRNA水平逐漸升高[5、10、15和20 d分別為（0.26±0.15）%、（6.28±2.79）%、（2.50±1.24）%和（2.73±0.85）%]，在感染后第10天達到高峰（圖2）。

圖2 MHV-3感染C3H/Hej小鼠肝組織IL-22 mRNA水平變化

2.3 肝組織SOCS3 mRNA水平變化在MHV-3誘導的C3H/Hej小鼠慢性肝損傷模型中，肝組織SOCS3 mRNA水平變化見圖3。隨著感染時間的延長，與0 d比，10、15、20 d小鼠肝臟組織SOCS3 mRNA水平顯著升高[（6.35±2.21）%對（16.92±4.39）%、（14.06±4.09）%、（13.36±1.89%），P＜0.05]，在感染后第10 d達到高峰（圖3）。

圖3 MHV-3感染C3H/Hej小鼠肝組織SOCS3 mRNA水平變化

3 討論

很多病因都可以引起慢性肝損傷，如病毒性肝炎、藥物、酒精中毒和循環(huán)障礙等。在我國，病毒性肝炎仍是引起慢性肝損傷的主要原因。在HBV感染所導致的肝損傷中，宿主免疫應答起到非常重要的作用[12]。在病毒感染早期，由免疫效應細胞介導的先天免疫被激活，產生相應的細胞因子，以達到控制病毒的目的，但免疫的激活和大量炎癥因子的釋放同時也可以引起肝臟損傷。

IL-22是一種重要的細胞因子。IL-22的表達與炎癥微環(huán)境有關。以往有研究表明IL-22在HBV感染中有一定的作用，但具體機制并不明確[13]。有研究報道IL-22的表達水平可能與ALT有一定的相關性[14]。IL-22水平的紊亂可能在HBV感染所導致的肝損傷中起到重要作用[15]。在我們構建的小鼠慢性肝損傷模型中，小鼠的肝損傷程度在10天時達到高峰，隨著感染時間的延長，C3H/Hej小鼠肝臟IL-22 mRNA水平顯著上調。有研究表明IL-22可以在某些疾病過程中起促炎作用。在小鼠實驗中，誘導產生的IL-22的變化促進了急性期的炎癥反應，包括誘導纖維蛋白原、人干擾素誘導蛋白-10（CXCL10）和血清淀粉樣蛋白A的產生，同時伴隨血小板、中性粒細胞和紅細胞計數(shù)增加。也有相關報道表明在許多上皮屏障表面，IL-22可預防感染和炎癥反應。例如，在IL-22基因敲除的小鼠模型中，肺炎克雷伯桿菌感染可導致小鼠迅速死亡[16]；在小鼠潰瘍性結腸炎模型中，IL-22可以降低局部腸道炎癥[17]。目前還有其他報道表明，IL-22同時也能調節(jié)細胞增殖、存活和組織修復[1]。在我們的研究中，在病毒感染過程中肝組織IL-22水平逐漸升高，并在10天時達到峰值，而肝臟炎癥損害也是在10天時最為明顯。因此，我們推測，IL-22參與了MHV-3誘導的C3H/Hej小鼠慢性肝炎的發(fā)生發(fā)展過程，從炎癥程度和IL-22的表達峰值時間點來看，我們認為IL-22與炎癥程度密切相關。我們推測，在這個過程中，IL-22對慢性肝損傷的作用可能是雙重的。一方面，IL-22在病毒感染時被激活而上調，可以誘導其他炎癥因子釋放，如IL-6、CXCL-10等，促進炎癥的發(fā)展；而另一面，IL-22也具有組織修復和延緩炎癥發(fā)生的作用。IL-22自身的表達調控是一個微妙的平衡，以此來控制炎癥的發(fā)生發(fā)展，其具體機制在將來還需進一步深入研究。

IL-22的產生與STAT家族的活化密切相關。SOCS3是可以調節(jié)STAT并與炎癥相關的重要因子，它作為JAK/STAT通路的負性調控基因被廣泛報道[4；5；8]，為了避免過度的免疫應答，SOCS3通過抑制活化的STAT3來調控炎癥反應。因此，SOCS3在炎癥中的作用至關重要。以往對SOCS3在慢性炎癥中作用研究仍存在一定的爭議。有研究表明，SOCS3通過抑制IL-6/gp130巨噬細胞起到促炎作用[18，19]。然而，在病理情況下，有相關的證據(jù)表明SOCS3能抑制IL-6相關的細胞因子而發(fā)揮重要作用。SOCS3對TOLL樣信號通路也有調控作用，可以通過調控TLR4信號通路來調控相關炎癥分子的釋放[20]。

以往有報道IL-22在CD3陽性T細胞表達依賴于STAT3活化。在肝纖維化相關研究也表明，肝損傷后IL-22的誘導需要STAT3激活[17，21]。SOCS3可以抑制STAT3的活化，負性調節(jié)JAK/STAT起到調控炎癥反應的作用[22]。上述研究表明SOCS3在一定程度上對IL-22有調控作用。目前也有研究表明，過表達SOCS3對IL-22所致的組織再生效應有抑制作用[23]。基于上述研究，我們在MHV-3誘導的小鼠慢性肝損傷模型中同時研究了SOCS3和IL-22表達。我們發(fā)現(xiàn)，SOCS3的表達和IL-22是一致的。SOCS3和IL-22在MHV-3感染過程中都升高，并于10天時達到高峰，而感染10天正是這一模型中炎癥最明顯的時間點。有研究表明IL-22可以上調SOCS3的表達以及相關炎性細胞因子的釋放，而激活的SOCS3反過來又可以抑制IL-22表達。在MHV-3誘導的小鼠慢性肝損傷模型中，我們的研究結果與以往研究類似。我們推測IL-22和SOCS3均參與了慢性肝損傷的發(fā)生發(fā)展。同時在慢性肝損傷中，SOCS3的產生對IL-22有調節(jié)作用。在慢性肝損傷中，SOCS3對IL-22的調控可能是通過兩個途徑實現(xiàn)的。一方面是負性調節(jié)STAT3的活化，在一定程度上調控IL-22表達[17，21]；另一方面，Th17細胞是IL-22產生的重要來源之一[24]。有相關研究表明SOCS3可以調節(jié)Th17細胞分化而影響IL-22的功能，以達到調控炎癥反應的目的[25，26]，即避免過度激活的免疫反應。SOCS3和IL-22的相互作用在MHV-3感染造成的肝臟損傷病理過程中可能起到重要作用，但是其具體的作用機制還有待進一步研究。

綜上所述，感染MHV-3后C3H/Hej小鼠體內IL-22和SOCS3表達增加，說明IL-22和SOCS3可能在MHV-3誘導的小鼠慢性肝炎的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，但是其具體的作用機制還有待進一步研究。通過對細胞因子和細胞因子抑制分子的深入研究，可能為慢性病毒性肝炎的致病機制提供新的理解，同時為治療提供一個全新的治療靶點。

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（收稿：2014-02-07）

（校對：陳從新）

Effect of IL-22 and SOCS3 in MHV-3 induced chronic viral hepatitis in mice

Li Yong，Lu Yulei，Wu

Ting，et al.Department and Institute of Infectious Disease，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 400030，Hubei Province，China

ObjectiveTo investigate the changes of interleukin-22（IL-22）and suppressor of cytokine signaling 3（SOCS3）mRNA in murine hepatitis virus 3（MHV-3）induced chronic viral hepatitis in C3H/Hej mice. MethodsChronic viral hepatitis in C3H/Hej mice was induced by intra-peritoneal injection of MHV-3 virus at dose of 100pfu.At day 0，5，10，15 and 20 post-infection，IL-22 and SOCS3 mRNA in the liver tissues were detected by real-time PCR.ResultsIL-22 and SOCS3 mRNA level in livers of model mice at day 0 were（0.26±0.15）% and（6.35±2.21）%，respectively.At day 10，15 and 20，IL-22 mRNA levelsin the liver tissues were（6.28±2.79）%，（2.50±1.24）%and（2.73±0.85）%，respectively，and SOCS3 mRNA levels were（16.92±4.39）%，（14.06±4.09）%and（13.36±1.89）%，respectively，all of which were markedly increased than baseline（P＜0.05）.The mRNA levels of IL-22 and SOCS3 both peaked at day 10 post MHV-3 infection.ConclusionsIL-22 and SOCS3 may play an important role in the pathogenesis of MHV-3-induced chronic viral hepatitis in mice.

Murine hepatitis virus 3；Chronic viral hepatitis；Interleikin-22；Suppressor of cytokine signaling 3；Mouse

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.04.017

國家自然科學基金項目（編號：NSFC81171558, NSFC81271808，NSFC81030007）；教育部創(chuàng)新團隊項目（編號：IRT1131）

430030武漢市華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院感染性疾病研究所/感染病科（李詠，吳婷，韓梅芳，寧琴）；廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院（陸玉蕾）

李詠，男，32歲，博士研究生。主要從事病毒性肝炎發(fā)病機制研究。E-mail:vamos_yong@hotmail.com

寧琴，E-mail:qning@vip.sina.com