蔣 文
( 重慶醫(yī)藥高等??茖W(xué)校,重慶401331)
人絨毛膜促性腺激素 (human chorionic gonadotropin,HCG) 是由胎盤組織的滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的一種重要糖蛋白,其生理功能是維持妊娠黃體及影響類固醇的產(chǎn)生,因此,HCG 的測(cè)定是早期妊娠(包括早孕、流產(chǎn)和異位妊娠等)和滋養(yǎng)細(xì)胞疾病(如葡萄胎、絨癌及滋養(yǎng)層腫瘤、前列腺癌和生殖細(xì)胞腫瘤等)診斷的重要指標(biāo)[1~4]。目前檢測(cè)HCG 的方法有放射免疫檢測(cè)法、酶聯(lián)免疫法、金標(biāo)試紙卡片檢測(cè)法、熒光標(biāo)記免疫檢測(cè)法、酶標(biāo)電泳法和電化學(xué)免疫分析法等。其中,電化學(xué)免疫傳感器因其檢測(cè)速度快、成本低、操作簡(jiǎn)單、攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)而越來(lái)越受人們的關(guān)注。
近年來(lái),納米材料基于大的比表面積、好的生物相容性以及高的表面反應(yīng)活性等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于生物傳感器的構(gòu)建,并極大地提高了傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性[5~7]。
該文采用超聲溶劑置換方法合成球形二茂鐵甲酸納米粒子,以Nafion 分散的多壁碳納米管與球形二茂鐵甲酸形成納米復(fù)合物,并將其固定在玻碳電極(GCE)表面,用EDC/NHS 將二茂鐵甲酸與L-半胱氨酸(L-Cys)交聯(lián),形成帶有巰基官能團(tuán)的復(fù)合膜,再鍵合沉積的納米金 (nano-Au),并通過(guò)納米金吸附人絨毛膜促性腺激素抗體(anti-HCG),最后用牛血清蛋白(BSA)封閉電極上的非特異性吸附位點(diǎn),從而制得了高靈敏的人絨毛膜促性腺激素免疫傳感器。Nafion-MWCNT-FcCOOH 復(fù)合膜具有良好的電化學(xué)氧化還原活性;電沉積納米金能阻止電活性探針從電極表面脫落,并為免疫反應(yīng)提供良好的生物相容性微環(huán)境,使免疫分子能保持較高的免疫活性;多壁碳納米管的引入,提高了電子傳遞速率,增強(qiáng)了傳感器的靈敏度、增大了檢測(cè)范圍和降低了檢測(cè)限。該實(shí)驗(yàn)方法具有電極制作簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)便,靈敏度高,重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和選擇性好等特點(diǎn)。
CHI660E型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司);AB204-S 電子天平(瑞士Mettler&Toledo 公司);pHS-3C型酸度計(jì) (上海大眾儀器公司);KQ218 超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器公司);透射電子顯微鏡(H-7500,日本Hitachi Instrument公司)。
人絨毛膜促性腺激素抗原(HCG)和人絨毛膜促性腺激素抗體(anti-HCG)(鄭州博賽生物試劑公司);多壁碳納米管(MWCNT,中科院成都有機(jī)所);氯金酸、牛血清白蛋白(BSA)、Nafion(Sigma,美國(guó));0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)做測(cè)試底液。其它試劑均為分析純?cè)噭?,?shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。
取0.1 g 二茂鐵甲酸溶于25 mL 的無(wú)水乙醇中,在超聲條件下以30 mL/min 速度加入125 mL去離子水,繼續(xù)超聲25 min,最后用去離子水洗滌、干燥,儲(chǔ)存?zhèn)溆肹8]。圖1為球形二茂鐵甲酸(FcCOOH)納米粒子的透射電鏡圖譜。
圖1 球形二茂鐵甲酸納米粒子的透射電鏡圖譜Fig.1 TEM image of spherical ferrocenecarboxylic acid nanoparticles
將1 mg MWCNT 和5 mg 球形FcCOOH 納米粒子加入至5 mL Nafion (0.25%) 的無(wú)水乙醇中,超聲震蕩分散2 h,得到分散均勻的Nafion-MWCNT-FcCOOH 納米復(fù)合物。
裸玻碳電極 (GCE,φ=4 mm ) 依次經(jīng)過(guò)1.0 μm、0.3 μm 和0.05 μm 的三氧化二鋁糊拋光后,再分別用去離子水、丙酮、乙醇、去離子水超聲洗滌、晾干備用。取10 μL Nafion-MWCNT-FcCOOH納米復(fù)合物懸濁液滴涂于GCE 表面并置于室溫晾干,然后置于EDC/NHS 活化液中活化2 h,再滴加10 μL L-半胱氨酸并過(guò)夜;將洗滌后的修飾電極浸入1%的氯金酸溶液中,在-0.2 V 恒定電位下沉積15 s;將修飾電極置于人絨毛膜促性腺激素HCG 抗體(anti-HCG)溶液中過(guò)夜(4℃),再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的牛血清白蛋白(BSA)封閉電極表面非特異性吸附位點(diǎn),從而制得所需的電化學(xué)免疫傳感器。圖2為免疫傳感器的制備過(guò)程示意圖。
利用循環(huán)伏安法(CV)對(duì)電極的制備過(guò)程進(jìn)行表征,檢測(cè)過(guò)程中被修飾的GCE為工作電極。以0.1 mol/L 的PBS(pH7.0)溶液作為測(cè)試底液,循環(huán)伏安法電位區(qū)間為0.0~0.5 V,掃描速率為50 mV/s。
圖2 免疫傳感器的修飾過(guò)程示意圖Fig.2 The modified process of the immunosensor
利用示差脈沖伏安法(DPV)來(lái)記錄修飾電極免疫反應(yīng)前后的電流值,其變化值即為對(duì)應(yīng)抗原HCG 濃度的響應(yīng)信號(hào),根據(jù)響應(yīng)信號(hào)與抗原濃度的線性關(guān)系進(jìn)行HCG 定量測(cè)定。
修飾電極在0.1 mol/L PBS(pH7.0)中的循環(huán)伏安(CV)掃描圖譜如圖3所示,裸的GCE 無(wú)氧化還原峰峰產(chǎn)生(圖3曲線a,插圖為其放大圖),圖3曲線b 是電極表面滴涂Nafion-MWCNTFcCOOH 納米復(fù)合物后的循環(huán)伏安圖,有一對(duì)明顯的二茂鐵甲酸的氧化還原峰,表明該電活性納米復(fù)合物成功修飾到電極表面。當(dāng)修飾L-半胱氨酸后,峰電流明顯減弱(圖3曲線c),這是因?yàn)長(zhǎng)-半胱氨酸阻礙了電子傳遞;當(dāng)沉積納米金后,由于納米金有利于電子傳輸,氧化還原峰電流又明顯增強(qiáng)(圖3曲線d);當(dāng)修飾HCG 抗體和BSA封閉后,由于蛋白分子對(duì)電子傳輸?shù)淖璧K作用,氧化還原峰峰值均降低(圖3曲線e 和曲線f)。
圖3 電極制備過(guò)程的循環(huán)伏安表征圖(a) 裸的GCE;(b)在GCE 表面滴涂Nafion-MWCNT-FcCOOH 復(fù)合物;(c) 組裝L-半胱氨酸層;(d) 沉積納米金;(e) 固定一層抗體膜;(f) 用BSA 封閉Fig.3 The diagram of the CVs of the stepwise
將BSA/anti-HCG/nano-Au/L-Cys/Nafion-MWCNT-FcCOOH 復(fù)合膜修飾的GCE 與BSA/anti-HCG/nano-Au/L-Cys/Nafion-FcCOOH 復(fù)合膜修飾的玻碳電極進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),有碳納米管修飾的電極峰電流(圖4曲線a)明顯高于無(wú)碳納米管修飾的電極峰電流 (圖4曲線b),表明MWCNT 的加入有助于增強(qiáng)傳感器的響應(yīng)電流,從而提高其靈敏度。
圖4 兩種修飾電極的循環(huán)伏安比較圖譜Fig.4 The comparison cyclic voltammetrys of two modified electrodes.(a)BSA/anti-HCG/nano-Au/L-Cys/Nafion-MWCNT-FcCOOH/GCE,(b)BSA/anti-HCG/nano-Au/LCys/Nafion-FcCOOH/GCE
圖5是該免疫傳感器在不同掃速下的循環(huán)伏安圖。隨著掃速?gòu)?0 mV/s 逐漸增加到500 mV/s,氧化峰和還原峰電流均不斷增大,且峰電流與掃速的平方根成正比(圖5插圖),表明該傳感器在緩沖液中的電化學(xué)過(guò)程受擴(kuò)散控制。
圖5 免疫傳感器在不同掃速下的循環(huán)伏安圖Fig.5 Cyclic voltammetrys of the immunosensor at different scan rates
2.3.1 沉積納米金的時(shí)間優(yōu)化
當(dāng)電沉積納米金的時(shí)間從5 s到15 s 逐漸增加時(shí),修飾電極的峰電流也逐漸增大,當(dāng)沉積時(shí)間超過(guò)15 s時(shí),電極的峰形和可逆性越來(lái)越差,因此選擇15 s為電沉積納米金的最優(yōu)時(shí)間。
2.3.2 測(cè)試液pH值的選擇
在pH值從5.0到9.0 范圍內(nèi)0.1mol/L PBS中該免疫傳感器的DPV 電流響應(yīng)變化情況 (如圖6)。當(dāng)pH值從5.0 增加到7.0時(shí),峰電流逐漸增加;pH 從7.0到9.0 增加時(shí),峰電流下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在pH為7.0時(shí),響應(yīng)電流最大。因此該實(shí)驗(yàn)選擇pH7.0 的PBS溶液作為測(cè)試底液。
2.3.3 孵育時(shí)間的優(yōu)化
將工作電極放入10.0 mIU/mL 的HCG 抗原溶液中孵育不同時(shí)間,在0.1 mol/L 的PBS(pH 7.0)中用DPV 測(cè)定其響應(yīng)電流的變化,其結(jié)果如圖7所示。從圖中可以看出,隨著時(shí)間的進(jìn)行,免疫反應(yīng)逐漸完成。當(dāng)孵育30 min 的時(shí)候,峰電流趨于平緩,說(shuō)明免疫反應(yīng)達(dá)到飽和。因此,該實(shí)驗(yàn)孵育時(shí)間選擇30 min為佳。
圖6 測(cè)試液pH值對(duì)免疫傳感器響應(yīng)的影響Fig.6 The effect of pH on the response of the immunosensor
在選定實(shí)驗(yàn)條件下,傳感器在不同濃度的HCG 標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育,圖8為免疫傳感器DPV峰電流信號(hào)對(duì)HCG 濃度對(duì)數(shù)的校準(zhǔn)曲線。圖中曲線a 和曲線b 分別為免疫電極BSA/anti-HCG/nano-Au/L-Cys/Nafion-MWCNT-FcCOOH/GCE
圖7 孵育時(shí)間對(duì)免疫反應(yīng)的影響Fig.7 The effect of incubation time on immunoreaction
(電極a) 和免疫電極BSA/anti-HCG/nano-Au/LCys/Nafion-FcCOOH/GCE(電極b)對(duì)HCG 濃度對(duì)數(shù)的校準(zhǔn)曲線,插圖為免疫電極a 的DPV 響應(yīng)曲線。免疫電極a 的線性范圍為0.05 mIU/mL~200 mIU/mL,最低檢測(cè)限為0.015 mIU/mL;作為對(duì)比,免疫電極b 的線性范圍為0.1 mIU/mL~200 mIU/mL,最低檢測(cè)限為0.04 mIU/mL。
將制備好的免疫電極分別置于不含和含有AFP、CEA、維生素C、L-半胱氨酸、L-賴氨酸和BSA 干擾物質(zhì)的0.1 mIU/mL HCG 抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育,并用上述方法檢測(cè),其電流響應(yīng)相差2.4%,表明該免疫傳感器具有良好的選擇性。
圖8 免疫傳感器對(duì)HCG 的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 Calibration plots of the immunosensor for detection of HCG.(a)BSA/anti-HCG/nano-Au/L-Cys/Nafion-MWCNT-FcCOOH modified GCE,(b)BSA/anti-HCG/nano-Au/L-Cys/Nafion-FcCOOH modified GCE
免疫電極的重現(xiàn)性考查采用5次檢測(cè)60.0 mIU/mL 的HCG 抗原,5次電流的響應(yīng)值分別為7.148、7.162、7.179、7.104 和7.212 μA,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.9%,表明該傳感器具有良好的重現(xiàn)性。
分別將標(biāo)準(zhǔn)濃度為0.5、5.0、25.0、50.0、100 mIU/mL 的HCG 加入到HCG 陰性血清中,用該免疫傳感器分別對(duì)其進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果列于表1中。加標(biāo)回收率在96.8%~104.0%之間,表明該免疫傳感器對(duì)HCG 的檢測(cè)是準(zhǔn)確的,有望運(yùn)用到臨床檢測(cè)中。
表1 血清加標(biāo)回收率Tab.1 The recovery of the prepared immunosensor in human serum
該文利用Nafion-MWCNT-FcCOOH 復(fù)合納米材料和納米金,成功構(gòu)建了高靈敏的電流型免疫傳感器。通過(guò)循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法考察了電極的電化學(xué)特性并對(duì)電極的性能進(jìn)行了研究。該免疫傳感器具有如以下優(yōu)點(diǎn):第一,Nafion-MWCNT-FcCOOH 復(fù)合膜具有良好的電化學(xué)氧化還原活性和電化學(xué)穩(wěn)定性;第二,電沉積的納米金可阻止電活性探針從電極表面的脫落,并為免疫反應(yīng)提供了一個(gè)良好的生物相容性的微環(huán)境,從而使免疫分子能保持較高的免疫活性;第三,MWCNT 的引入,增強(qiáng)了傳感器的靈敏度、增大了檢測(cè)范圍和降低了檢測(cè)限;第四,該免疫傳感器具有制備過(guò)程簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和選擇性好等特點(diǎn)。另外,該方法也可用于其它免疫物質(zhì)的測(cè)定,在臨床腫瘤標(biāo)志物的診斷方面有一定的潛在應(yīng)用價(jià)值。
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