可樂定對永久性腦梗死大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及對神經(jīng)干細(xì)胞增生的影響

朱 琳，李建成，馬東明，姜正林，李永財(cái)，何 鵬，許世輝

α2 腎上腺素受體激動(dòng)劑可樂定臨床上作為中樞性降壓藥使用。一些研究表明，α2 受體激動(dòng)劑能拮抗低氧、腦缺血、興奮性毒性引起的腦損傷，縮小腦梗死體積，能通過延長抽搐和死亡的潛伏期達(dá)到拮抗嚴(yán)重的急性缺氧引起的腦損傷［1～3］。若使用α2-受體阻滯劑，則會(huì)增加重型缺氧的早產(chǎn)胎羊的神經(jīng)元損傷［1］。Dean 等利用早產(chǎn)胎羊臍帶阻斷缺血模型的研究顯示，可樂定(10 μg/kg/h)治療可以增加存活的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)［1］。Hang 發(fā)現(xiàn)腦缺血前6～24 h給予可樂定(40 μg/kg)預(yù)處理，可改善神經(jīng)功能評分并減少梗死范圍，而同時(shí)使用α2 受體阻滯劑拮抗可樂定的這一神經(jīng)保護(hù)作用［2］。葉春玲等研究表明，可樂定可提高小鼠和貓腦缺血缺氧后的動(dòng)物存活率和腦電活動(dòng)［3］。

因此，本研究通過制備大鼠永久性腦梗死模型(permanent middle cerebral artery occlusion，PMCAO)，使用可樂定治療，觀察大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況，測量腦梗死體積，尼氏染色后進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)，BrdU-nestin 免疫熒光雙標(biāo)檢測增生的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目以及采用ELISA 方法檢測神經(jīng)再生相關(guān)因子在腦組織中的表達(dá)，進(jìn)一步探討可樂定的神經(jīng)保護(hù)作用，并觀察其對神經(jīng)干細(xì)胞增生的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 成年雄性Sprague-Dawley 大鼠120只，SPF 級，體重260～280 g，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號:SCXK(蘇)2008-0010。

1.2 動(dòng)物分組及藥物使用 大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分組。于術(shù)后3 h 開始腹腔注射給藥，每24 h 一次，連續(xù)使用5 d，或至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。缺血對照組給予等劑量的生理鹽水(1 ml/kg)，假手術(shù)組不注射藥物或生理鹽水。實(shí)驗(yàn)過程中，大鼠因麻醉意外、缺血損傷等原因死亡16 只，其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)未納入統(tǒng)計(jì)。各處理組大鼠死亡率無顯著差異。實(shí)驗(yàn)分組情況，神經(jīng)行為與細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn):假手術(shù)組(8 只)、缺血對照組(10 只，死亡2 只)、可樂定治療50 μg/kg組(10 只，死亡2 只)、可樂定治療100 μg/kg 組(10只，死亡2 只);梗死體積測定:假手術(shù)組(9 只)、缺血對照組(11 只，死亡2 只)、可樂定治療50 μg/kg組(11 只，死亡2 只);神經(jīng)再生相關(guān)因子測定:假手術(shù)組(6 只)、缺血對照組(7 只，死亡1 只)、可樂定治療50 μg/kg 組(7 只，死亡1 只);干細(xì)胞增生檢測:假手術(shù)組(9 只)、缺血對照組(11 只，死亡2只)、可樂定治療50 μg/kg 組(11 只，死亡2 只)。

1.3 試劑及儀器 可樂定、氯化三苯基四氮唑(TTC)購自Sigma 公司，尼龍栓線(北京生物沙東生物技術(shù)有限公司)，動(dòng)物恒溫手術(shù)臺(tái)(MA22 蘇州市蘇杭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備廠)，冰凍切片機(jī)(Laica CM1900，德國)，數(shù)碼相機(jī)(Cannon Powershot S60，日本)，大鼠NGF、NCAM-L1、TN-C、GDNF、Nogo-A 的ELISA檢測試劑盒(上海繼錦化學(xué)科技有限公司)，熒光顯微鏡(Leica 319861，DM4000B)，酶標(biāo)儀(Elx-800，美國 Bio-TEK 公 司)，5-Bromo-2 ’-Deoxy Uridine(B5002，Sigma)，Anti-nestin antibody produced in rabbit(N5413，Sigma)，F(xiàn)luorescein(FITC)-conjugated Affinipure Donkey Anti-Mouse IgG(Jackson)，Anti-Rabbit IgG(whole molecule)-FITC antibody produced in goat(Sigma)。

1.4 缺血模型制備 參照Lorenz(2009)改良方法，采用線栓法制作PMCAO 模型。予10%水合氯醛(0.35 g/kg，i.p)麻醉大鼠后，取頸部正中線切開，分離大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，用0 號縫合線結(jié)扎CCA近心端及ECA 起始部，夾閉ICA，在CCA 上作一小切口，栓線(直徑0.18 mm)從CCA 插入ICA，深度距ECA 分叉處為(18.5±0.5)mm，有阻擋感，此時(shí)栓線即穿過MCA 起始段并達(dá)到大腦前動(dòng)脈(ACA)近端。固定栓線并結(jié)扎，縫合皮膚。假手術(shù)組栓線插入深度為1 cm，其余步驟同前。動(dòng)物蘇醒后缺血對側(cè)肢體痛覺刺激缺失及運(yùn)動(dòng)障礙視為模型成功。

1.5 神經(jīng)行為學(xué)評分 參照MNSS(modified neurological severity scores)18 分制評分法綜合性評分，反映大鼠運(yùn)動(dòng)、感覺、反射及平衡功能。13～18分提示嚴(yán)重?fù)p害;7～12 分提示中度損害;1～6 分提示輕度損害，正常動(dòng)物為0 分。在術(shù)前及術(shù)后1、2、3、4、5 d 分別對各組動(dòng)物采用盲法進(jìn)行行為學(xué)檢測。

1.6 尼氏染色與神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù) 大鼠術(shù)后5 d，深度麻醉下暴露心臟，穿刺針經(jīng)心尖部刺入左心室至主動(dòng)脈根部，固定，剪破右心耳，血液流出，先用350 ml 生理鹽水快速?zèng)_洗，后用4 ℃的4%多聚甲醛灌注，取腦，多聚甲醛中固定24 h，先后在20%、30%的蔗糖溶液中脫水，切片，尼氏染色，取缺血側(cè)前囟后1.7 mm～2.3 mm 海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、皮質(zhì)區(qū)，高倍鏡(×400 倍)下計(jì)算各區(qū)完整的錐體細(xì)胞數(shù)，每張切片計(jì)數(shù)3 個(gè)區(qū)域，連續(xù)取7 張腦片，取平均數(shù)為該腦梗死側(cè)CA1區(qū)、CA3區(qū)、皮質(zhì)區(qū)的存活細(xì)胞數(shù)。

1.7 腦梗死體積測量 術(shù)后3 d，深度麻醉大鼠，斷頭取腦，去除嗅球放入腦槽，-20 ℃冷凍10 min。從額極到枕極作額狀切片，厚度2 mm，腦片置于1%TTC 溶液中，37 ℃避光孵育30 min，間隔10 min 翻動(dòng)腦片。后置于4 %多聚甲醛緩沖液中固定，過夜。拍攝的圖像以Image pro plus(IPP)軟件處理，計(jì)算梗死面積(紅色為正常腦組織，白色為梗死區(qū))，梗死體積(mm3)=非缺血側(cè)半球體積-缺血側(cè)半球未梗死區(qū)體積，腦梗死體積百分比(%)=梗死體積(mm3)/全腦體積(mm3)×100%。

1.8 神經(jīng)再生相關(guān)因子檢測 大鼠于術(shù)后第6 天，深度麻醉下斷頭取損傷則腦組織，勻漿、提取蛋白，用BCA 法通過蛋白濃度測定試劑盒行蛋白定量。然后采用大鼠ELISA 試劑盒測定各神經(jīng)再生相關(guān)因子(GDNF、NCAM、NGF、Nogo-A、TN-C)的濃度。取出板條復(fù)溫，先后加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP 標(biāo)記的檢測抗體，溫浴后徹底洗滌，用底物TMB 顯色，TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長下測定吸光度(OD 值)，計(jì)算樣品濃度，后以樣品濃度除以總蛋白濃度，最后得出單位總蛋白中所含樣品的量。

1.9 BrdU-nestin 免疫熒光雙標(biāo) 于大鼠術(shù)后第3、4、5 天分別腹腔注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2’-DeoxyUridine，BrdU)溶 液(50 mg/kg，bid))。術(shù)后第6 天灌注、取材、固定、脫水、切片，后行BrdU-Nestin 免疫熒光雙標(biāo)檢測。BrdU(1∶500，sigma);nestin(1∶100，sigma)。取缺血側(cè)海馬區(qū)前、中、后部共3 張腦片，用熒光顯微鏡采集圖片，拼合雙標(biāo)圖片，高倍鏡(×200 倍)下計(jì)算皮質(zhì)缺血損傷區(qū)周邊、海馬CA3區(qū)及海馬DG 區(qū)BrdU-nestin 雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)，該大鼠缺血側(cè)該區(qū)域的細(xì)胞數(shù)為3張腦片的平均值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，神經(jīng)功能缺損評分采用秩和檢驗(yàn);其余數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，兩兩比較用Scheffe 法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 可樂定減輕大鼠PMCAO 后的腦損傷。

2.1.1 神經(jīng)行為學(xué)評分 假手術(shù)組神經(jīng)功能正常，其神經(jīng)行為學(xué)評分均為0 分，故表1 中未列出。腦缺血大鼠均有不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，其中缺血對照組最嚴(yán)重。與缺血對照組比較，術(shù)后第4 天、第5 天，可樂定50 μg/kg 治療組神經(jīng)功能缺損癥狀明顯改善(P＜0.01 或P＜0.05)，100 μg/kg 治療組的作用略好于50 μg/kg 治療組，但兩者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表1)。

2.1.2 神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù) 大鼠PMCAO 后5 d，假手術(shù)組海馬組織無明顯損傷，CA1、CA3區(qū)錐體細(xì)胞層次清楚，結(jié)構(gòu)完整，尼氏體豐富，細(xì)胞核大而圓，核仁明顯;皮質(zhì)部位神經(jīng)元形態(tài)正常，細(xì)胞排列較緊密，胞核飽滿，核仁清晰。缺血對照組缺血側(cè)海馬組織有明顯損傷，主要表現(xiàn)在CA1、CA3區(qū)大量錐體細(xì)胞缺失，殘存細(xì)胞排列紊亂，形態(tài)不規(guī)則，尼氏體減少或消失，胞核固縮，核仁欠清;缺血側(cè)皮質(zhì)部著色明顯變淡，神經(jīng)元縮小變形，核固縮，尼氏體消失?？蓸范?0 μg/kg 治療組和100 μg/kg 治療組海馬與皮質(zhì)損傷減輕，表現(xiàn)為缺血側(cè)海馬錐體細(xì)胞排列較整齊緊密，胞核飽滿，核仁較清，CA1、CA3區(qū)錐體細(xì)胞缺失或胞核固縮較少;缺血側(cè)皮質(zhì)部神經(jīng)元形態(tài)基本完整，尼氏體豐富，胞核飽滿，核仁清晰。細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，與缺血對照組相比，可樂定治療組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)目增多(P＜0.05 或P＜0.01)，并且100 μg/kg 治療組多于50 μg/kg 治療組(P＜0.05，見表2);在海馬CA3區(qū)，可樂定50 μg/kg、100 μg/kg治療組錐體細(xì)胞數(shù)目也明顯多于缺血對照組(P＜0.01)，但兩個(gè)劑量組之間的差異無顯著性(見表2);皮質(zhì)損傷灶周圍區(qū)域，可樂定治療組錐體細(xì)胞數(shù)目明顯增多(P＜0.01)，并且100 μg/kg治療組多于50 μg/kg 治療組(P＜0.01，見表2)。

2.1.3 梗死體積 術(shù)后3 d，TTC 染色紅色為非梗死區(qū)，白色為梗死區(qū)。梗死區(qū)與右側(cè)MCA 供血區(qū)一致。假手術(shù)組未見梗死灶(n=9)，缺血對照組有較大的梗死體積(29.80%±1.64%，n=9)，可樂定(50 μg/kg)治療組腦梗死體積為(19.15%±1.14%，n=9)，較缺血對照組明顯縮小(P＜0.01)。

2.2 可樂定促進(jìn)大鼠PMCAO 后神經(jīng)再生相關(guān)因子的表達(dá) 與假手術(shù)組相比，腦缺血損傷后第6 天，缺血對照組及可樂定(50 μg/kg)治療組大鼠損傷側(cè)腦組織中神經(jīng)再生相關(guān)因子GDNF、NCAM、NGF、Nogo-A、TN-C 含量均顯著增加，與缺血對照組比較，可樂定組大鼠損傷側(cè)腦組織中上述因子的含量進(jìn)一步增加，特別是Nogo-A 與TN-C 含量的增加有顯著性意義(P＜0.01 或P＜0.05，見表3)。

2.3 可樂定促進(jìn)大鼠PMCAO 后神經(jīng)干細(xì)胞的增生 腦缺血損傷后第6 天，在大鼠皮質(zhì)缺血損傷區(qū)周邊可觀察到BrdU 和nestin 雙標(biāo)陽性的細(xì)胞。BrdU 可摻入S 期細(xì)胞DNA，以此標(biāo)記可觀察細(xì)胞增生，結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物，雙重染色，可以反映增生細(xì)胞的種類。BrdU 和nestin 共標(biāo)的細(xì)胞可認(rèn)為是增生的神經(jīng)干細(xì)胞。缺血對照組和可樂定(50 μg/kg)治療組皮質(zhì)缺血損傷區(qū)周邊均可見增生的神經(jīng)干細(xì)胞，分別為15.2±1.3 個(gè)(n=9)、22.3±0.3 個(gè)(n=9);假手術(shù)組為1.0±0.2 個(gè)(n=9)。與缺血對照組相比，可樂定組神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目的增加更明顯(P＜0.01)。

表1 可樂定對大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分的影響(±s)

表1 可樂定對大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分的影響(±s)

與缺血對照組比較* P＜0.05，＊＊P＜0.01

表2 可樂定對海馬與皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響(±s)

表2 可樂定對海馬與皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響(±s)

與缺血對照組比較* P＜0.01;與可樂定50 μg/kg 組比較#P＜0.05，##P＜0.01

表3 可樂定對損傷側(cè)腦組織神經(jīng)再生相關(guān)因子表達(dá)的影響(ng/ml，±s)

表3 可樂定對損傷側(cè)腦組織神經(jīng)再生相關(guān)因子表達(dá)的影響(ng/ml，±s)

與假手術(shù)組比較* P＜0.01;與缺血對照組比較#P＜0.05，##P＜0.01

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道可樂定具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抑制腦內(nèi)去甲腎上腺素的釋放有關(guān)［1～3］。腦缺血后海馬和紋狀體等部位釋放的去甲腎上腺素會(huì)加重?fù)p傷，這與其增加神經(jīng)元對谷氨酸的敏感性，加劇興奮性毒性有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)可樂定治療可改善pMCAO 大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀，減少缺血損傷后神經(jīng)元的丟失，縮小梗死體積，與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)相符。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)可樂定治療能促進(jìn)大鼠損傷側(cè)腦組織中神經(jīng)再生相關(guān)因子-膠質(zhì)細(xì)胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(NCAM)、神經(jīng)生長因子(NGF)、髓鞘相關(guān)生長抑制因子(Nogo-A)、肌腱蛋白C(TN-C)的表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道NGF在培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元中能抑制代謝性和興奮性毒性損傷［4］。長爪沙鼠腦缺血前后，腦室內(nèi)注射NGF 可以減少海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡［5］。下調(diào)NCAM 導(dǎo)致MCAO 模型小鼠梗死體積增大，加劇神經(jīng)元損害［6］。靜脈注射基因修飾的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞過表達(dá)GDNF，可減輕大鼠腦缺血后的神經(jīng)功能缺損，縮小梗死體積［7］。在腦出血?jiǎng)游锬Ｐ?，GDNF有神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)功能恢復(fù)的作用［8］。Nogo-A 蛋白導(dǎo)入體外培養(yǎng)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元能拮抗外源性過氧化氫引起的氧化應(yīng)激［9］。因此，本研究結(jié)果提示可樂定對腦缺血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用可能與上調(diào)上述因子的表達(dá)、營養(yǎng)與保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷有一定的關(guān)系。

成年雄性猴注射NGF 能保護(hù)梗死皮質(zhì)神經(jīng)元，減少退變，促進(jìn)神經(jīng)芽生和突觸發(fā)生［10］。NCAM 可刺激軸突和樹突及其分支的生長，穩(wěn)定突觸和促進(jìn)記憶形成［11］，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)再生和突觸重塑中發(fā)揮重要作用。有文獻(xiàn)報(bào)道Nogo-A 能抑制軸突生長［12］，但也有人認(rèn)為Nogo-A 不抑制軸突再生。例如，發(fā)育的神經(jīng)元胞體和軸突表面、軸突的生長錐中均有Nogo-A 表達(dá)，但其并未抑制軸突生長，暗示它與軸突生長有關(guān)［13］。脊髓損傷后，GDNF 能防止運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性，促進(jìn)軸突和髓鞘生長［14］。帕金森病基礎(chǔ)和臨床研究表明，紋狀體中注入GDNF 能阻止黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元退變，促進(jìn)軸突生長。TN-C 對神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、功能形成和對皮質(zhì)、海馬及小腦的神經(jīng)可塑性有重要作用［15］。在體研究表明，TN-C 沿生長錐伸展分布，誘導(dǎo)軸突生長，可出現(xiàn)在順行性變性及損傷后再生的神經(jīng)中。TN-C 還促進(jìn)有絲分裂活動(dòng)，外周神經(jīng)自體移植入丘腦，神經(jīng)內(nèi)膜及施萬細(xì)胞髓鞘內(nèi)再生的丘腦神經(jīng)軸索表面可出現(xiàn)大量TNC。因此，可樂定通過增強(qiáng)上述神經(jīng)再生相關(guān)因子的表達(dá)，可能會(huì)促進(jìn)神經(jīng)元突起的生長、突觸重塑，改善神經(jīng)功能缺損癥狀。

NCAM 在細(xì)胞增生、遷移、軸突生長、突觸傳導(dǎo)和突觸可塑性中起重要作用［16］。神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)的TN-C 可促進(jìn)細(xì)胞增生、遷移和軸突生長、延長［17］。GDNF 能促進(jìn)神經(jīng)元的遷移和分化，與其引起分化相關(guān)的基因表達(dá)有關(guān)。在缺血缺氧新生大鼠模型中植入多能星形膠質(zhì)干細(xì)胞，NGF、GDNF 能促進(jìn)干細(xì)胞的遷移和分化［18］。Nogo-A 調(diào)節(jié)腦皮質(zhì)神經(jīng)元的放射狀遷移，Nogo-A 基因敲除小鼠的前腦神經(jīng)前體細(xì)胞放射狀遷移受到干擾［19］。本研究發(fā)現(xiàn)可樂定治療組BrdU-nestin 共標(biāo)的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目明顯增多，表明可樂定可能通過促進(jìn)以上因子的表達(dá)，誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的增生，繼而分化為具有功能的神經(jīng)元，并遷移到相關(guān)功能區(qū)，修復(fù)損傷的腦組織及促進(jìn)神經(jīng)功能的進(jìn)一步恢復(fù)，這為臨床應(yīng)用可樂定治療缺血性卒中提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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