蘇云金芽孢桿菌原生質(zhì)體制備與再生研究

宋利丹　鄭毅　周勇

摘 要：主要研究了菌齡、酶濃度、酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)蘇云金芽孢桿菌原生質(zhì)體制備和再生的影響。通過(guò)正交試驗(yàn)確定了蘇云金芽孢桿菌制備和再生的最佳條件，當(dāng)酶濃度為1.0mg/mL，酶解時(shí)間為80min，酶解溫度為30℃時(shí)，原生質(zhì)體的制備率和再生率達(dá)到最高，分別為98.14%和58.14%。

關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢桿菌；原生質(zhì)體；制備；再生

中圖分類(lèi)號(hào) S476.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2014）03-04-20-02

引言

基因組改組技術(shù)是近幾年迅速發(fā)展的微生物育種技術(shù)，在菌種特性改良和提高產(chǎn)量等方面取得了一系列成果[1]。原生質(zhì)體制備、再生與融合技術(shù)是基因組改組育種的重要技術(shù)基礎(chǔ)，由于各種微生物細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)不同，不同菌種原生質(zhì)體制備和再生的條件也不相同[2-3]，較高的原生質(zhì)體制備率和再生率是育種成功的必要條件。本研究擬開(kāi)展蘇云金芽孢桿菌基因組改組菌種選育，通過(guò)酶解法制備蘇云金芽孢桿菌原生質(zhì)體，主要研究了菌齡、酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備和再生的影響，優(yōu)化出原生質(zhì)體制備與再生的最佳條件，為進(jìn)一步進(jìn)行原生質(zhì)體的融合、選育優(yōu)良重組的菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 菌種 蘇云金芽孢桿菌FS42，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基 （1）斜面（平板）培養(yǎng)基（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化鈉5，瓊脂20。pH7.0～7.2。

（2）再生培養(yǎng)基（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化鈉5，瓊脂20，蔗糖171.15。pH7.0～7.2。

（3）種子培養(yǎng)液（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化鈉5。pH7.0～7.2。

2 方法

2.1 菌種活化 從保種斜面挑取一環(huán)，平板劃線，37℃恒溫培養(yǎng)箱放置24h。

2.2 種子培養(yǎng) 從活化的平板上挑取成熟的單菌落接入種子培養(yǎng)基（裝液量50mL/250mL三角瓶），置于 30℃ 230r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)11h。

2.3 原生質(zhì)體制備與再生

2.3.1 原生質(zhì)體的制備 （1）挑取成熟的單菌落接入液體培養(yǎng)基（裝液量50mL/250mL三角瓶），置于30℃ 230r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)11h，2%轉(zhuǎn)接新鮮的液體培養(yǎng)基（裝液量50mL/250mL三角瓶），恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)3h，加3%的甘氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)4h。（2）吸取3mL菌液，加入3mL0.75mg/mL溶菌酶液，40℃水浴低速振蕩60min。（3）吸取0.1mL菌液，用無(wú)菌水稀釋至一定梯度，吸取0.1mL涂于平板上，37℃培養(yǎng)24h，計(jì)算其菌落數(shù)（A值）。

2.3.2 原生質(zhì)體的再生 （1）用高滲緩沖液將制備好的原生質(zhì)體懸液稀釋至一定梯度，吸取0.lmL涂于再生培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，計(jì)算其菌落數(shù)（C值）。（2）吸取0.1mL制備好的原生質(zhì)體懸液，用無(wú)菌水稀釋至一定梯度，靜置20min，使其充分脹破，最后吸取0.1mL涂于平板上，37℃培養(yǎng)24h，計(jì)算其菌落數(shù)（B值）。

2.3.3 制備率和再生率計(jì)算公式 （1）制備率（%）=（A-B）/A×100；（2）再生率（%）=（C-B）/（A-B）×100。其中，A：總菌落數(shù)；B：未被酶解的菌數(shù)；C：原生質(zhì)體再生菌數(shù)與未酶解菌總數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)優(yōu)化

3.1.1 溶菌酶濃度對(duì)原生質(zhì)體制備與再生的影響 采用酶法制備蘇云金芽孢桿菌FS42原生質(zhì)，取預(yù)培養(yǎng)的菌液（接后培養(yǎng)3h，加3%甘氨酸，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)4h），其它制備條件不變，溶菌酶濃度為0.5mg/mL、0.75mg/mL、1.0mg/mL，以考察不同濃度對(duì)原生質(zhì)體制備與再生的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1可以看出，當(dāng)溶菌酶濃度為1.0mg/mL時(shí)，原生質(zhì)體制備率達(dá)到最高，為82.63%，原生質(zhì)體的制備率隨酶濃度的增加而升高，但提高幅度較緩慢。當(dāng)溶菌酶濃度為0.5mg/mL時(shí)，再生率達(dá)到最高，而隨著酶濃度的增加，再生率逐漸下降，由12.1%下降至3.14%。由此可見(jiàn)，酶濃度的增加不利于原生質(zhì)體的再生。雖然高濃度的酶制備率比較高，但再生率卻很低。其原因可能是高濃度的溶菌酶使細(xì)胞壁被裂解得太徹底，進(jìn)一步對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)生毒害，使其失去再生能力，從而再生率下降。

3.1.2 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備與再生的影響 采用0.5mg/mL溶菌酶酶解，其它制備條件不變，分別酶解作用40min、60min、80min，考察不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備與再生的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明：酶解時(shí)間對(duì)其原生質(zhì)體制備率和再生率有較大的影響。當(dāng)酶解時(shí)間為60min，制備率與再生率的乘積達(dá)到最大，若繼續(xù)延長(zhǎng)裂解的時(shí)間，雖然制備率有略微上升，但其再生率快速下降，造成這種結(jié)果可能是因?yàn)椋涸|(zhì)體的形成需要一定的酶解時(shí)間，酶解時(shí)間太短，則形成的數(shù)量少，直接影響其再生率；若時(shí)間太長(zhǎng)，酶活力顯著下降且脫壁太徹底，使細(xì)胞壁失去再生的引物，對(duì)酶的損害也越大，使再生率大大降低[4]。

3.1.3 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備與再生的影響

采用酶解時(shí)間為60min，其它條件不變，考察35℃、40℃、45℃ 3個(gè)酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備和再生的影響。由圖3可知，隨著溫度的升高，制備率逐漸升高，但變化較為緩慢，酶解溫度為45℃時(shí)，制備率達(dá)到最大，為99.76%。隨著溫度的升高，再生率逐漸下降。酶解溫度為35～40℃，雖然制備率變化緩慢，但對(duì)再生率的影響非常明顯，由17%下降至4.17%。根據(jù)酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)可知，隨著溫度的升高，酶反應(yīng)速度加快，但是酶反應(yīng)的溫度過(guò)高，則會(huì)導(dǎo)致酶的失活，而降低酶解的能力，同時(shí)破壞了原生質(zhì)體的活性，造成原生質(zhì)體再生率顯著下降。

3.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化原生質(zhì)體制備與再生條件 單因素優(yōu)化結(jié)果表明，酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)原生質(zhì)制備與再生有重要影響，通過(guò)正交試驗(yàn)考察3因素對(duì)原生質(zhì)體制備與再生的綜合影響，采用3因素3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表1。以原生質(zhì)制備率為考察指標(biāo)，正交極差分析表明，酶解濃度在原生質(zhì)體制備中起主導(dǎo)作用。當(dāng)溫度為35℃、酶解濃度為1.0mg/mL、酶解時(shí)間為60min時(shí)，原生質(zhì)體的制備率最高。以再生率為考察指標(biāo)，正交極差分析表明，酶解溫度在原生質(zhì)體再生中起主導(dǎo)作用。當(dāng)溫度為30℃、酶解濃度為1.0mg/mL、酶解時(shí)間為80min時(shí)，原生質(zhì)體的制備率均值最大，說(shuō)明在這3個(gè)條件下，原生質(zhì)體的制備效果最好。

綜合單因素與正交試驗(yàn)可知，酶解濃度對(duì)原生質(zhì)體制備影響最大，酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體再生的影響最大。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果分析確定蘇云金芽孢桿菌原生質(zhì)體制備與再生的最優(yōu)條件為：取轉(zhuǎn)接后3h加甘氨酸，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)4h的菌體，在1.0mg/mL的溶菌酶溶液中，30℃酶解80min，此條件下，制備率達(dá)98.14%，同時(shí)再生率也可達(dá)58.14%。

參考文獻(xiàn)

[1]陳勁春，尉渤，周代福. 原生質(zhì)體技術(shù)在工業(yè)微生物育種中的應(yīng)用[J].工業(yè)微生物，1997（04）：37-39.

[2]李麒，武井直樹(shù). 納豆在保健和醫(yī)療上的應(yīng)用價(jià)值[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2002（4）：57-60.

[3]劉新梅，高宇，趙靜，等.納豆菌原生質(zhì)體制備與再生條件的研究[J].食品科學(xué)，2007（5）：231-236.

[4]劉伊強(qiáng)，王雅平，潘乃穟，等.芽孢桿菌原生質(zhì)體的形成、再生及種間融合的研究[J].微生物學(xué)報(bào)，1994（1）：76-80.

[5]朱志春.基因組改組選育類(lèi)球紅細(xì)菌輔酶Q10高產(chǎn)菌株[D].福建師范大學(xué)，2012.

[6]喬寶義，徐浩.棒狀桿菌原生質(zhì)體的形成、再生以及融合的初步探討[J].微生物學(xué)報(bào)，1983（1）：33-43.

[7]雷虹，曾偉民，金忠斌，等.小白鏈霉菌（Streptomyces Albulus）的原生質(zhì)體制備研究[J].黑龍江大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2007（3）：306-309.

（責(zé)編：施婷婷）

摘 要：主要研究了菌齡、酶濃度、酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)蘇云金芽孢桿菌原生質(zhì)體制備和再生的影響。通過(guò)正交試驗(yàn)確定了蘇云金芽孢桿菌制備和再生的最佳條件，當(dāng)酶濃度為1.0mg/mL，酶解時(shí)間為80min，酶解溫度為30℃時(shí)，原生質(zhì)體的制備率和再生率達(dá)到最高，分別為98.14%和58.14%。

關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢桿菌；原生質(zhì)體；制備；再生

中圖分類(lèi)號(hào) S476.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2014）03-04-20-02

引言

基因組改組技術(shù)是近幾年迅速發(fā)展的微生物育種技術(shù)，在菌種特性改良和提高產(chǎn)量等方面取得了一系列成果[1]。原生質(zhì)體制備、再生與融合技術(shù)是基因組改組育種的重要技術(shù)基礎(chǔ)，由于各種微生物細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)不同，不同菌種原生質(zhì)體制備和再生的條件也不相同[2-3]，較高的原生質(zhì)體制備率和再生率是育種成功的必要條件。本研究擬開(kāi)展蘇云金芽孢桿菌基因組改組菌種選育，通過(guò)酶解法制備蘇云金芽孢桿菌原生質(zhì)體，主要研究了菌齡、酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備和再生的影響，優(yōu)化出原生質(zhì)體制備與再生的最佳條件，為進(jìn)一步進(jìn)行原生質(zhì)體的融合、選育優(yōu)良重組的菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 菌種 蘇云金芽孢桿菌FS42，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基 （1）斜面（平板）培養(yǎng)基（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化鈉5，瓊脂20。pH7.0～7.2。

（2）再生培養(yǎng)基（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化鈉5，瓊脂20，蔗糖171.15。pH7.0～7.2。

（3）種子培養(yǎng)液（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化鈉5。pH7.0～7.2。

2 方法

2.1 菌種活化 從保種斜面挑取一環(huán)，平板劃線，37℃恒溫培養(yǎng)箱放置24h。

2.2 種子培養(yǎng) 從活化的平板上挑取成熟的單菌落接入種子培養(yǎng)基（裝液量50mL/250mL三角瓶），置于 30℃ 230r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)11h。

2.3 原生質(zhì)體制備與再生

2.3.1 原生質(zhì)體的制備 （1）挑取成熟的單菌落接入液體培養(yǎng)基（裝液量50mL/250mL三角瓶），置于30℃ 230r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)11h，2%轉(zhuǎn)接新鮮的液體培養(yǎng)基（裝液量50mL/250mL三角瓶），恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)3h，加3%的甘氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)4h。（2）吸取3mL菌液，加入3mL0.75mg/mL溶菌酶液，40℃水浴低速振蕩60min。（3）吸取0.1mL菌液，用無(wú)菌水稀釋至一定梯度，吸取0.1mL涂于平板上，37℃培養(yǎng)24h，計(jì)算其菌落數(shù)（A值）。

2.3.2 原生質(zhì)體的再生 （1）用高滲緩沖液將制備好的原生質(zhì)體懸液稀釋至一定梯度，吸取0.lmL涂于再生培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，計(jì)算其菌落數(shù)（C值）。（2）吸取0.1mL制備好的原生質(zhì)體懸液，用無(wú)菌水稀釋至一定梯度，靜置20min，使其充分脹破，最后吸取0.1mL涂于平板上，37℃培養(yǎng)24h，計(jì)算其菌落數(shù)（B值）。

2.3.3 制備率和再生率計(jì)算公式 （1）制備率（%）=（A-B）/A×100；（2）再生率（%）=（C-B）/（A-B）×100。其中，A：總菌落數(shù)；B：未被酶解的菌數(shù)；C：原生質(zhì)體再生菌數(shù)與未酶解菌總數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)優(yōu)化

3.1.1 溶菌酶濃度對(duì)原生質(zhì)體制備與再生的影響 采用酶法制備蘇云金芽孢桿菌FS42原生質(zhì)，取預(yù)培養(yǎng)的菌液（接后培養(yǎng)3h，加3%甘氨酸，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)4h），其它制備條件不變，溶菌酶濃度為0.5mg/mL、0.75mg/mL、1.0mg/mL，以考察不同濃度對(duì)原生質(zhì)體制備與再生的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1可以看出，當(dāng)溶菌酶濃度為1.0mg/mL時(shí)，原生質(zhì)體制備率達(dá)到最高，為82.63%，原生質(zhì)體的制備率隨酶濃度的增加而升高，但提高幅度較緩慢。當(dāng)溶菌酶濃度為0.5mg/mL時(shí)，再生率達(dá)到最高，而隨著酶濃度的增加，再生率逐漸下降，由12.1%下降至3.14%。由此可見(jiàn)，酶濃度的增加不利于原生質(zhì)體的再生。雖然高濃度的酶制備率比較高，但再生率卻很低。其原因可能是高濃度的溶菌酶使細(xì)胞壁被裂解得太徹底，進(jìn)一步對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)生毒害，使其失去再生能力，從而再生率下降。

3.1.2 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備與再生的影響 采用0.5mg/mL溶菌酶酶解，其它制備條件不變，分別酶解作用40min、60min、80min，考察不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備與再生的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明：酶解時(shí)間對(duì)其原生質(zhì)體制備率和再生率有較大的影響。當(dāng)酶解時(shí)間為60min，制備率與再生率的乘積達(dá)到最大，若繼續(xù)延長(zhǎng)裂解的時(shí)間，雖然制備率有略微上升，但其再生率快速下降，造成這種結(jié)果可能是因?yàn)椋涸|(zhì)體的形成需要一定的酶解時(shí)間，酶解時(shí)間太短，則形成的數(shù)量少，直接影響其再生率；若時(shí)間太長(zhǎng)，酶活力顯著下降且脫壁太徹底，使細(xì)胞壁失去再生的引物，對(duì)酶的損害也越大，使再生率大大降低[4]。

3.1.3 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備與再生的影響

采用酶解時(shí)間為60min，其它條件不變，考察35℃、40℃、45℃ 3個(gè)酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備和再生的影響。由圖3可知，隨著溫度的升高，制備率逐漸升高，但變化較為緩慢，酶解溫度為45℃時(shí)，制備率達(dá)到最大，為99.76%。隨著溫度的升高，再生率逐漸下降。酶解溫度為35～40℃，雖然制備率變化緩慢，但對(duì)再生率的影響非常明顯，由17%下降至4.17%。根據(jù)酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)可知，隨著溫度的升高，酶反應(yīng)速度加快，但是酶反應(yīng)的溫度過(guò)高，則會(huì)導(dǎo)致酶的失活，而降低酶解的能力，同時(shí)破壞了原生質(zhì)體的活性，造成原生質(zhì)體再生率顯著下降。

3.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化原生質(zhì)體制備與再生條件 單因素優(yōu)化結(jié)果表明，酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)原生質(zhì)制備與再生有重要影響，通過(guò)正交試驗(yàn)考察3因素對(duì)原生質(zhì)體制備與再生的綜合影響，采用3因素3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表1。以原生質(zhì)制備率為考察指標(biāo)，正交極差分析表明，酶解濃度在原生質(zhì)體制備中起主導(dǎo)作用。當(dāng)溫度為35℃、酶解濃度為1.0mg/mL、酶解時(shí)間為60min時(shí)，原生質(zhì)體的制備率最高。以再生率為考察指標(biāo)，正交極差分析表明，酶解溫度在原生質(zhì)體再生中起主導(dǎo)作用。當(dāng)溫度為30℃、酶解濃度為1.0mg/mL、酶解時(shí)間為80min時(shí)，原生質(zhì)體的制備率均值最大，說(shuō)明在這3個(gè)條件下，原生質(zhì)體的制備效果最好。

綜合單因素與正交試驗(yàn)可知，酶解濃度對(duì)原生質(zhì)體制備影響最大，酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體再生的影響最大。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果分析確定蘇云金芽孢桿菌原生質(zhì)體制備與再生的最優(yōu)條件為：取轉(zhuǎn)接后3h加甘氨酸，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)4h的菌體，在1.0mg/mL的溶菌酶溶液中，30℃酶解80min，此條件下，制備率達(dá)98.14%，同時(shí)再生率也可達(dá)58.14%。

參考文獻(xiàn)

[1]陳勁春，尉渤，周代福. 原生質(zhì)體技術(shù)在工業(yè)微生物育種中的應(yīng)用[J].工業(yè)微生物，1997（04）：37-39.

[2]李麒，武井直樹(shù). 納豆在保健和醫(yī)療上的應(yīng)用價(jià)值[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2002（4）：57-60.

[3]劉新梅，高宇，趙靜，等.納豆菌原生質(zhì)體制備與再生條件的研究[J].食品科學(xué)，2007（5）：231-236.

[4]劉伊強(qiáng)，王雅平，潘乃穟，等.芽孢桿菌原生質(zhì)體的形成、再生及種間融合的研究[J].微生物學(xué)報(bào)，1994（1）：76-80.

[5]朱志春.基因組改組選育類(lèi)球紅細(xì)菌輔酶Q10高產(chǎn)菌株[D].福建師范大學(xué)，2012.

[6]喬寶義，徐浩.棒狀桿菌原生質(zhì)體的形成、再生以及融合的初步探討[J].微生物學(xué)報(bào)，1983（1）：33-43.

[7]雷虹，曾偉民，金忠斌，等.小白鏈霉菌（Streptomyces Albulus）的原生質(zhì)體制備研究[J].黑龍江大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2007（3）：306-309.

（責(zé)編：施婷婷）

摘 要：主要研究了菌齡、酶濃度、酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)蘇云金芽孢桿菌原生質(zhì)體制備和再生的影響。通過(guò)正交試驗(yàn)確定了蘇云金芽孢桿菌制備和再生的最佳條件，當(dāng)酶濃度為1.0mg/mL，酶解時(shí)間為80min，酶解溫度為30℃時(shí)，原生質(zhì)體的制備率和再生率達(dá)到最高，分別為98.14%和58.14%。

關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢桿菌；原生質(zhì)體；制備；再生

中圖分類(lèi)號(hào) S476.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2014）03-04-20-02

引言

基因組改組技術(shù)是近幾年迅速發(fā)展的微生物育種技術(shù)，在菌種特性改良和提高產(chǎn)量等方面取得了一系列成果[1]。原生質(zhì)體制備、再生與融合技術(shù)是基因組改組育種的重要技術(shù)基礎(chǔ)，由于各種微生物細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)不同，不同菌種原生質(zhì)體制備和再生的條件也不相同[2-3]，較高的原生質(zhì)體制備率和再生率是育種成功的必要條件。本研究擬開(kāi)展蘇云金芽孢桿菌基因組改組菌種選育，通過(guò)酶解法制備蘇云金芽孢桿菌原生質(zhì)體，主要研究了菌齡、酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備和再生的影響，優(yōu)化出原生質(zhì)體制備與再生的最佳條件，為進(jìn)一步進(jìn)行原生質(zhì)體的融合、選育優(yōu)良重組的菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 菌種 蘇云金芽孢桿菌FS42，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基 （1）斜面（平板）培養(yǎng)基（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化鈉5，瓊脂20。pH7.0～7.2。

（2）再生培養(yǎng)基（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化鈉5，瓊脂20，蔗糖171.15。pH7.0～7.2。

（3）種子培養(yǎng)液（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化鈉5。pH7.0～7.2。

2 方法

2.1 菌種活化 從保種斜面挑取一環(huán)，平板劃線，37℃恒溫培養(yǎng)箱放置24h。

2.2 種子培養(yǎng) 從活化的平板上挑取成熟的單菌落接入種子培養(yǎng)基（裝液量50mL/250mL三角瓶），置于 30℃ 230r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)11h。

2.3 原生質(zhì)體制備與再生

2.3.1 原生質(zhì)體的制備 （1）挑取成熟的單菌落接入液體培養(yǎng)基（裝液量50mL/250mL三角瓶），置于30℃ 230r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)11h，2%轉(zhuǎn)接新鮮的液體培養(yǎng)基（裝液量50mL/250mL三角瓶），恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)3h，加3%的甘氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)4h。（2）吸取3mL菌液，加入3mL0.75mg/mL溶菌酶液，40℃水浴低速振蕩60min。（3）吸取0.1mL菌液，用無(wú)菌水稀釋至一定梯度，吸取0.1mL涂于平板上，37℃培養(yǎng)24h，計(jì)算其菌落數(shù)（A值）。

2.3.2 原生質(zhì)體的再生 （1）用高滲緩沖液將制備好的原生質(zhì)體懸液稀釋至一定梯度，吸取0.lmL涂于再生培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，計(jì)算其菌落數(shù)（C值）。（2）吸取0.1mL制備好的原生質(zhì)體懸液，用無(wú)菌水稀釋至一定梯度，靜置20min，使其充分脹破，最后吸取0.1mL涂于平板上，37℃培養(yǎng)24h，計(jì)算其菌落數(shù)（B值）。

2.3.3 制備率和再生率計(jì)算公式 （1）制備率（%）=（A-B）/A×100；（2）再生率（%）=（C-B）/（A-B）×100。其中，A：總菌落數(shù)；B：未被酶解的菌數(shù)；C：原生質(zhì)體再生菌數(shù)與未酶解菌總數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)優(yōu)化

3.1.1 溶菌酶濃度對(duì)原生質(zhì)體制備與再生的影響 采用酶法制備蘇云金芽孢桿菌FS42原生質(zhì)，取預(yù)培養(yǎng)的菌液（接后培養(yǎng)3h，加3%甘氨酸，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)4h），其它制備條件不變，溶菌酶濃度為0.5mg/mL、0.75mg/mL、1.0mg/mL，以考察不同濃度對(duì)原生質(zhì)體制備與再生的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1可以看出，當(dāng)溶菌酶濃度為1.0mg/mL時(shí)，原生質(zhì)體制備率達(dá)到最高，為82.63%，原生質(zhì)體的制備率隨酶濃度的增加而升高，但提高幅度較緩慢。當(dāng)溶菌酶濃度為0.5mg/mL時(shí)，再生率達(dá)到最高，而隨著酶濃度的增加，再生率逐漸下降，由12.1%下降至3.14%。由此可見(jiàn)，酶濃度的增加不利于原生質(zhì)體的再生。雖然高濃度的酶制備率比較高，但再生率卻很低。其原因可能是高濃度的溶菌酶使細(xì)胞壁被裂解得太徹底，進(jìn)一步對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)生毒害，使其失去再生能力，從而再生率下降。

3.1.2 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備與再生的影響 采用0.5mg/mL溶菌酶酶解，其它制備條件不變，分別酶解作用40min、60min、80min，考察不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備與再生的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明：酶解時(shí)間對(duì)其原生質(zhì)體制備率和再生率有較大的影響。當(dāng)酶解時(shí)間為60min，制備率與再生率的乘積達(dá)到最大，若繼續(xù)延長(zhǎng)裂解的時(shí)間，雖然制備率有略微上升，但其再生率快速下降，造成這種結(jié)果可能是因?yàn)椋涸|(zhì)體的形成需要一定的酶解時(shí)間，酶解時(shí)間太短，則形成的數(shù)量少，直接影響其再生率；若時(shí)間太長(zhǎng)，酶活力顯著下降且脫壁太徹底，使細(xì)胞壁失去再生的引物，對(duì)酶的損害也越大，使再生率大大降低[4]。

3.1.3 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備與再生的影響

采用酶解時(shí)間為60min，其它條件不變，考察35℃、40℃、45℃ 3個(gè)酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備和再生的影響。由圖3可知，隨著溫度的升高，制備率逐漸升高，但變化較為緩慢，酶解溫度為45℃時(shí)，制備率達(dá)到最大，為99.76%。隨著溫度的升高，再生率逐漸下降。酶解溫度為35～40℃，雖然制備率變化緩慢，但對(duì)再生率的影響非常明顯，由17%下降至4.17%。根據(jù)酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)可知，隨著溫度的升高，酶反應(yīng)速度加快，但是酶反應(yīng)的溫度過(guò)高，則會(huì)導(dǎo)致酶的失活，而降低酶解的能力，同時(shí)破壞了原生質(zhì)體的活性，造成原生質(zhì)體再生率顯著下降。

3.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化原生質(zhì)體制備與再生條件 單因素優(yōu)化結(jié)果表明，酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)原生質(zhì)制備與再生有重要影響，通過(guò)正交試驗(yàn)考察3因素對(duì)原生質(zhì)體制備與再生的綜合影響，采用3因素3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表1。以原生質(zhì)制備率為考察指標(biāo)，正交極差分析表明，酶解濃度在原生質(zhì)體制備中起主導(dǎo)作用。當(dāng)溫度為35℃、酶解濃度為1.0mg/mL、酶解時(shí)間為60min時(shí)，原生質(zhì)體的制備率最高。以再生率為考察指標(biāo)，正交極差分析表明，酶解溫度在原生質(zhì)體再生中起主導(dǎo)作用。當(dāng)溫度為30℃、酶解濃度為1.0mg/mL、酶解時(shí)間為80min時(shí)，原生質(zhì)體的制備率均值最大，說(shuō)明在這3個(gè)條件下，原生質(zhì)體的制備效果最好。

綜合單因素與正交試驗(yàn)可知，酶解濃度對(duì)原生質(zhì)體制備影響最大，酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體再生的影響最大。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果分析確定蘇云金芽孢桿菌原生質(zhì)體制備與再生的最優(yōu)條件為：取轉(zhuǎn)接后3h加甘氨酸，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)4h的菌體，在1.0mg/mL的溶菌酶溶液中，30℃酶解80min，此條件下，制備率達(dá)98.14%，同時(shí)再生率也可達(dá)58.14%。

參考文獻(xiàn)

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（責(zé)編：施婷婷）