生化黃腐酸對(duì)3種腫瘤細(xì)胞體外增殖影響的初步研究

高金崗 陳沫 何濱

(海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院熱帶動(dòng)植物生態(tài)學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室 ?？?571158)

生化黃腐酸對(duì)3種腫瘤細(xì)胞體外增殖影響的初步研究

高金崗 陳沫 何濱

(海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院熱帶動(dòng)植物生態(tài)學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室 ?？?571158)

本試驗(yàn)采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法，研究了生化黃腐酸對(duì)3種腫瘤細(xì)胞(人胃癌細(xì)胞株SGC、人肝癌細(xì)胞株SPCA和人肺癌細(xì)胞株BEL)在體外增殖的影響。在3種不同腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)分別加入6種不同濃度的生化黃腐酸，用酶標(biāo)儀測(cè)定3種不同培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的吸光值(OD值)，計(jì)算生化黃腐酸對(duì)3種不同腫瘤細(xì)胞的抑制率。試驗(yàn)結(jié)果表明：在各個(gè)濃度下，生化黃腐酸對(duì)3種不同腫瘤細(xì)胞的抑制率均低于50%，屬于非敏感型藥物。生化黃腐酸對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外增殖沒有明顯的直接抑制作用，且在某種濃度下，生化黃腐酸可能對(duì)腫瘤細(xì)胞有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。

生化黃腐酸 腫瘤細(xì)胞 MTT法 細(xì)胞體外增殖

腫瘤是危害人類健康的惡性疾病之一。近幾年來(lái)，腫瘤患者的病死率有上升趨勢(shì)[1]?？鼓[瘤藥物在抑制癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)損害人體的正常細(xì)胞。由于化療藥物的毒副作用大，且易產(chǎn)生耐藥性。因此，尋找敏感、毒副作用小的抗腫瘤藥物就顯得非常必要。

生化黃腐酸(Biotechnology Fulvic Acid，簡(jiǎn)稱BFA)是以作物秸稈等有機(jī)物為主要原料，經(jīng)過微生物發(fā)酵而產(chǎn)生的以黃腐酸為主要成分且含有多種生物活性物質(zhì)的復(fù)合物[2]。其來(lái)源天然，毒副作用極小，長(zhǎng)期使用不會(huì)產(chǎn)生耐藥性[3，4]。

有報(bào)道認(rèn)為，BFA作為飼料添加劑能明顯提高動(dòng)物的抗炎能力[5，6]。臨床試驗(yàn)也證明，黃腐酸鈉在止血、抗炎、止痛和調(diào)整腸胃功能等方面具有重要作用[7]。張覃沐等[8]報(bào)道，煤炭黃腐酸對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用，而對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠艾氏腹水癌細(xì)胞(ECA)無(wú)明顯毒性作用。關(guān)于BFA是否對(duì)體外腫瘤細(xì)胞有直接的影響作用尚未見報(bào)道。因此，本文以人胃癌細(xì)胞株SGC、人肝癌細(xì)胞株SPCA和人肺癌細(xì)胞株BEL共3種腫瘤細(xì)胞為研究對(duì)象，初步研究了BFA對(duì)腫瘤細(xì)胞體外增殖的影響，以探討B(tài)FA對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)是否具有直接的抑制作用，從而為BFA的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試細(xì)胞株

人胃癌細(xì)胞株SGC、人肝癌細(xì)胞株SPCA和人肺癌細(xì)胞株BEL，均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)(ATCC)。

1.2 試驗(yàn)儀器

倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；立式超低溫冰箱(丹麥Heto公司)；高壓滅菌鍋(日本森展企業(yè)有限公司)；可調(diào)式移液器(BRAND公司)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Pore公司)等。

1.3 試驗(yàn)藥品及處理方法

1.3.1 試驗(yàn)藥品

BFA(購(gòu)自上海通微生物技術(shù)有限公司，棕褐色粉末，BFA含量≥95%)；胰蛋白酶(購(gòu)自Gibco公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，購(gòu)自Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO，購(gòu)自天津市化學(xué)試劑二廠)；RPMI-1640培養(yǎng)基(購(gòu)自Gibeo公司)；優(yōu)級(jí)新生胎牛血清(購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司)；80萬(wàn)單位的青霉素和100萬(wàn)單位的鏈霉素(均購(gòu)自海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑室)。

1.3.2 藥品處理

(1)RPMI-1640血清培養(yǎng)基：RPMI-1640血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基1袋，NaHCO33.7 g，用1000mL三蒸水溶解，磁力攪拌，調(diào)pH=7.5。

(2)胰蛋白酶(0.25%)：胰蛋白酶0.5 g，三蒸水200mL，磁性攪拌，待完全溶解后，用直徑為0.22μm雙層濾膜過濾除菌，-20℃保存。

(3)PBS緩沖液：NaCl 8.0g(pH 7.2～7.4)，KCl 0.2 g，NaH2PO41.44 g，KH2PO40.24 g，三蒸水1000mL，高壓滅菌，室溫保存。

(4)胎牛血清：-20℃保存，取出室溫融化，之后，放入56 ℃恒溫槽中，恒定30min滅活，分裝，-20℃保存。

(5)抗菌素液(雙抗液)：用注射器吸5 mL PBS，注入鏈霉素(100萬(wàn)單位)瓶?jī)?nèi)，反復(fù)吹打，使其完全溶解，然后吸出4 mL再注入青霉素(80萬(wàn)單位)瓶?jī)?nèi)，反復(fù)吹打，使其完全溶解。吸出全部于一小燒杯，加PBS至100mL，在超凈臺(tái)內(nèi)用過濾器分裝，每瓶5 mL，20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(6)MTT溶液：MTT 50mg，加PBS 50mL，攪拌溶解，用直徑為0.22μm的濾膜過濾除菌后，4 ℃避光保存，一周內(nèi)使用。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇

從液氮罐中取出凍存的SGC、SPCA和BEL細(xì)胞株，迅速放入37 ℃水浴中，使其在1 min內(nèi)完全溶解，將細(xì)胞懸液移至離心管(內(nèi)裝含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液)中，在4 ℃、1000rpm/min下離心3 min，棄上清液，將細(xì)胞重新懸浮于RPMI-1640培養(yǎng)液(內(nèi)含10%胎牛血清)中，置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后觀察細(xì)胞貼壁情況，并更換一次培養(yǎng)液。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存復(fù)蘇的3種細(xì)胞株分別裝在有適量RPMI-1640培養(yǎng)液(內(nèi)含10%胎牛血清和雙抗液)的培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱中，在恒溫37 ℃、5% CO2濃度、飽和濕度下培養(yǎng)。

每3～4天傳代一次，傳代時(shí)小心棄去舊培養(yǎng)液，用PBS緩沖液(pH7.4)沖洗2次，棄去PBS緩沖液，加入適量0.25%胰蛋白酶，37 ℃，消化1～2 min，倒置鏡下觀察細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度，加RPMI-1640培養(yǎng)液(內(nèi)含10%胎牛血清)終止消化，用吹打管將已經(jīng)消化好的細(xì)胞吹打?yàn)榧?xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液由細(xì)胞培養(yǎng)瓶中吸入離心管中，1000rpm/min離心5 min；離心后棄去上清液，再加入新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)液(內(nèi)含10%胎牛血清)，用微量進(jìn)樣器輕輕反復(fù)吹打細(xì)胞懸液，使細(xì)胞重懸混勻后，分裝于培養(yǎng)瓶中再培養(yǎng)。

1.4.3 細(xì)胞凍存

在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，防止試驗(yàn)過程中操作不當(dāng)造成細(xì)胞完全死亡，可以將一部分細(xì)胞凍存起來(lái)。凍存細(xì)胞時(shí)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。凍存方法如下：將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)、離心、去上清，加入含10%二甲基亞砜(DMSO)的凍存液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞重懸，使細(xì)胞密度達(dá)到5×106個(gè)/毫升，分裝入無(wú)菌凍存管中，先在4 ℃條件下放置45 min，然后置于-20℃再放置45 min，最后在-80℃下過夜，逐級(jí)降溫冷凍，然后放入液氮罐中保存。

1.4.4 細(xì)胞鋪板

鋪板前處理：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后吹打成單個(gè)懸浮細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將結(jié)果代入下式：細(xì)胞個(gè)數(shù)/毫升原液=(四角大格中細(xì)胞數(shù)之和/4)×104，接著用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞的濃度，使SGC細(xì)胞的濃度達(dá)4×104個(gè)/毫升，SPCA細(xì)胞濃度達(dá)2×104個(gè)/毫升，BEL細(xì)胞濃度達(dá)7×104個(gè)/毫升。

將調(diào)整好濃度的3種細(xì)胞分別加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板B行到F行中，每孔180μL，鋪兩行吹勻一次，A行每孔加200μL RPMI-1640培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，分別置于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4.5 藥品溶解及稀釋

用電子天平稱量BFA100mg，在超凈臺(tái)內(nèi)用1 mL的DMSO溶解，待溶解后用移液器混勻，將母液稀釋成不同的濃度，分別為：0.1 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、10mg/mL、50mg/mL、100mg/mL。將6個(gè)濃度的BFA藥品分別依次加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的D、E、F行中；A行設(shè)置空白組(僅加入不含細(xì)胞的培養(yǎng)液)，B、C兩行是對(duì)照組(以培養(yǎng)液替代藥物)，然后置于37 ℃、5% CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各濃度BFA在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上的安排見表1。

表1 細(xì)胞板上各孔的濃度Tab.1 The concentration of each hole on the cell board

1.4.6 MTT法[9]測(cè)吸光值(OD值)

加藥44 h后，向3個(gè)細(xì)胞板中分別加入MTT溶液，每孔50μL。4 h后，將培養(yǎng)板中培養(yǎng)的3種細(xì)胞的液體倒掉，加入DMSO，每孔150μL，震蕩10min，使用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔OD值。

根據(jù)抑制率公式[10]：抑制率(%)=(對(duì)照組OD值-試驗(yàn)組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%，分別計(jì)算不同濃度的BFA對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的抑制率。

各項(xiàng)試驗(yàn)均重復(fù)3次以上，用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS處理。試驗(yàn)組與對(duì)照組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法，以P＜0.05為差異具有顯著性意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 BFA對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的影響

根據(jù)上述抑制率公式，分別計(jì)算不同濃度的BFA對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的抑制率，繪制抑制率曲線，見圖1～圖3。同時(shí)，依據(jù)吳舟鋒[11]使用的判斷藥物是否是腫瘤細(xì)胞敏感型藥物的標(biāo)準(zhǔn)(抑制率＜50%為不敏感；50%～70%為中度敏感；＞70%為高度敏感)進(jìn)行判斷。

圖1 生化黃腐酸對(duì)SGC的影響Fig.1 The in fl uence of biochemistry fulvic acid on SGC

由圖1可見，不同濃度BFA對(duì)SGC的抑制率不同。在0.1～1 mg/mL濃度范圍內(nèi)，抑制率表現(xiàn)為逐漸下降趨勢(shì)；在1～10mg/mL濃度范圍內(nèi)則表現(xiàn)為逐漸增加，至10mg/mL濃度時(shí)達(dá)到40.96%抑制率，接近最大抑制率(約42.50%)；之后又逐漸減少。各濃度BFA對(duì)SGC細(xì)胞的抑制率均未達(dá)到50%。

圖2 生化黃腐酸對(duì)SPCA的影響Fig2. The in fl uence of biochemistry fulvic acid on SPCA

由圖2可見，不同濃度BFA對(duì)SPCA的抑制率不同。在0.1～1 mg/mL范圍內(nèi)，抑制率表現(xiàn)出明顯地下降趨勢(shì)，至1 mg/mL時(shí)，抑制率為負(fù)值；而在1～10mg/mL范圍內(nèi)，抑制率則表現(xiàn)為逐漸增加趨勢(shì)，至10mg/mL濃度時(shí)，抑制率達(dá)到8.53%，接近最大值(約8.85%)；之后，隨著濃度增加，抑制率又逐漸降低，當(dāng)濃度為50～100mg/mL時(shí)，抑制率變化趨于平穩(wěn)，但均為負(fù)值。各濃度的BFA對(duì)SPCA細(xì)胞的抑制率遠(yuǎn)未達(dá)到50%。

圖3 生化黃腐酸對(duì)BEL的影響Fig.3 The in fl uence of biochemistry fulvic acid on BEL

由圖3可知，不同濃度BFA對(duì)BEL的抑制率不同。在0.1～1 mg/mL濃度范圍內(nèi)，抑制率表現(xiàn)為小幅增加趨勢(shì)；而在1～5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，則表現(xiàn)為下降趨勢(shì)；當(dāng)濃度為5～10mg/mL時(shí)，抑制率又逐漸增加，至10mg/mL濃度時(shí)，抑制率達(dá)到9.48%，接近最大值(約9.90%)；之后，隨著濃度的增加，抑制率大幅度下降，在50～100mg/mL濃度范圍內(nèi)，抑制率均為負(fù)值，當(dāng)濃度達(dá)到中100mg/mL時(shí)，抑制率約為-54.93%。各濃度BFA對(duì)BEL細(xì)胞的抑制率均未達(dá)到50%。

2.2 BFA對(duì)3種腫瘤細(xì)胞抑制結(jié)果的分析

為了進(jìn)一步判斷BFA對(duì)3種腫瘤細(xì)胞體外增殖的抑制作用，根據(jù)各濃度試驗(yàn)組所得OD值與對(duì)照組OD值進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果見表2。另外，計(jì)算出的抑制率也放入表2，用以對(duì)BFA的抑制作用進(jìn)行輔助分析?？梢?，SPCA細(xì)胞組中6個(gè)濃度試驗(yàn)組與對(duì)照組相比均沒有顯著差異(P＜0.05)，表明BFA對(duì)SPCA細(xì)胞沒有抑制作用。而SGC細(xì)胞組中，有3個(gè)濃度(5 mg/mL、10mg/mL和50mg/mL)與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)或極顯著性差異(P＜0.01)；BEL細(xì)胞組中，有2個(gè)濃度(50mg/mL和100mg/mL)與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)或極顯著性差異(P＜0.01)，但這5個(gè)試驗(yàn)組對(duì)SGC和BEL細(xì)胞的抑制率都低于50%，表明BFA對(duì)這2種腫瘤細(xì)胞也沒有明顯的抑制作用。

表2 BFA對(duì)3種不同腫瘤細(xì)胞的抑制作用(n=6)Tab.2 Anti-proliferative activity of biochemistry fulvic acid on three tumor cells(n=6)

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明：BFA對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的體外增殖沒有明顯的直接抑制作用。

在濃度達(dá)到10mg/mL時(shí)，BFA對(duì)SGC的抑制率達(dá)到40.96%，其最大抑制率約為42.50%(圖2)，接近了50%的抑制率。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果也表明：BFA對(duì)SGC具有抑制作用，其中有3個(gè)濃度(5 mg/mL、10mg/mL和50mg/mL)試驗(yàn)組與對(duì)照組相比有顯著性差異。BFA對(duì)SGC的體外生長(zhǎng)可能有一定的影響，但由于BFA的3個(gè)濃度的抑制率均小于50%，沒有明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用；而BFA對(duì)SGC和BEL兩種腫瘤細(xì)胞抑制率更低，6個(gè)濃度的抑制率均未達(dá)到10%。因此，認(rèn)為BFA不是腫瘤細(xì)胞敏感型藥物，對(duì)癌細(xì)胞本身沒有直接的抑制或殺滅作用。

張覃沐等[8]報(bào)道，煤炭黃腐酸對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠艾氏腹水癌細(xì)胞(ECA)無(wú)明顯毒性作用；而在體內(nèi)對(duì)小鼠腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用，且口服比注射效果要好。他們認(rèn)為，煤炭黃腐酸可能是通過提高小鼠自身免疫系統(tǒng)的功能而發(fā)揮其抗腫瘤作用的，而不是直接抑制或殺滅腫瘤細(xì)胞，本研究結(jié)論支持此觀點(diǎn)。

本試驗(yàn)結(jié)果還顯示：當(dāng)BFA的濃度較高(＞50mg/mL)時(shí)，對(duì)SPCA和BEL細(xì)胞株的負(fù)面影響很小(圖2和圖3)：抑制率很低，甚至出現(xiàn)負(fù)值。由此推測(cè)：因?yàn)锽FA具有一定的抑菌作用[12]，又含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，在體外腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)體系中，加入一定濃度的BFA，可能有益于細(xì)胞的增殖，有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

雖然本試驗(yàn)結(jié)果表明BFA不是腫瘤細(xì)胞敏感型藥物，對(duì)腫瘤細(xì)胞本身沒有直接的殺滅作用，但由于BFA來(lái)源于天然，毒副作用很小，長(zhǎng)期使用不易產(chǎn)生耐藥性,在確定有效活性組成后，BFA有可能作為腫瘤患者化療時(shí)的輔助用藥使用，提高腫瘤患者的免疫力。

致謝：本文在試驗(yàn)過程中得到了海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳忠教授的指導(dǎo)和幫助，在此表示感謝！

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The Preliminary Study of Biochemical Fulvic Acidon the Proliferation of Three Types of Tumor Cells in Vitro

Gao Jingang, Chen Mo, He Bin
(Co-constructing Key Labs by Hainan Province and Ministry of Education for Tropical Animal and Plant Ecology,School of Life Sciences, Hainan Normal University, Haikou, 571158)

In this experiment, three kinds of cancer cells, SGC, SPCA and BEL as the object was studied The [3-(4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide]method (MTT)was applied to study on the influence of three kinds of tumor cell proliferation in vitro. Six different concentrations of biochemical fulvic acid were added into the three different cultured tumor cells. The OD values of three different cultured tumor cells were measured, and the concentration of cell inhibition rate of each was calculated. The results showed that the inhibitions of biochemical fulvic acid on three different tumor cells were less than 50% in all concentrations, indicating that they were not sensitive. The proliferation of three different tumor cells did not induce directly inhibited by biochemical fulvic acid. In addition, biochemical fulvic acid could promot growth of the tumor cells to some extent.

biochemical fulvic acid; tumor cell; MTT method, cell proliferation in vitro

TQ314.1，R730.1

A

1671-9212(2014)03-0022-06

2013-11-11

高金崗，男，1957年生，副教授。主要從事細(xì)胞生物學(xué)和酶組織化學(xué)方面的研究。E-mail:gf6363@sina.com。