微型絲網(wǎng)印刷電極快速檢測克侖特羅的方法

梁 樺，宋 偉，許丹科，劉 英，鐘文英,*

（1.中國藥科大學(xué)理學(xué)院，江蘇 南京 211198；2.南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 南京 210093；3.南京祥中生物科技有限公司，江蘇 南京 210022）

微型絲網(wǎng)印刷電極快速檢測克侖特羅的方法

梁 樺1，宋 偉2，許丹科2，劉 英3，鐘文英1,*

（1.中國藥科大學(xué)理學(xué)院，江蘇 南京 211198；2.南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 南京 210093；3.南京祥中生物科技有限公司，江蘇 南京 210022）

研制能用于96孔酶標(biāo)板快速檢測的微型絲網(wǎng)印刷電極，并建立克侖特羅的電化學(xué)分析方法。通過間接競爭免疫反應(yīng)與計(jì)時(shí)電流法相結(jié)合實(shí)現(xiàn)克侖特羅的殘留量的定量測定。實(shí)驗(yàn)中考察并優(yōu)化免疫反應(yīng)與酶催化反應(yīng)的條件。結(jié)果表明：在優(yōu)化的條件下，克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度在0.025～2.0 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系（r為0.999 2）。采用本實(shí)驗(yàn)方法檢測豬肉和豬尿中克侖特羅的結(jié)果與商品化ELISA試劑盒一致。本方法檢測限分別為0.18 μg/L和0.05 μg/L，比ELISA試劑盒檢測限低一個(gè)數(shù)量級。

微型絲網(wǎng)印刷電極；克侖特羅；計(jì)時(shí)電流法；電化學(xué)免疫傳感

克侖特羅（clenbuterol）俗稱瘦肉精，屬于β-興奮劑，近年來被非法添加到飼料中以促進(jìn)動(dòng)物骨骼肌的生長和提高瘦肉率，因其添加劑量是治療劑量的5～10 倍，并且在動(dòng)物體內(nèi)殘留量過高而給消費(fèi)者帶來危害，所以對食品中克侖特羅的檢測尤為重要[1-2]。目前克侖特羅檢測方法主要有色譜方法和免疫分析技術(shù)。高效液相色譜法[3-4]具有靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但儀器成本高，不適合樣品篩選和現(xiàn)場快速檢測。免疫分析技術(shù)包括膠體金試紙條[5-6]和酶聯(lián)免疫法[7-8]。膠體金試紙條具有測定簡單、快速、成本低等特點(diǎn)，但難于準(zhǔn)確定量。酶聯(lián)免疫分析方法具有靈敏度高、可定量檢測，適合樣品快速篩選分析，然而由于目前酶聯(lián)免疫檢測中采用光學(xué)酶標(biāo)儀體積較大，一般不適宜攜帶進(jìn)行現(xiàn)場的快速檢測。

電化學(xué)分析方法具有靈敏度高、儀器易于小型化、操作簡單等特點(diǎn)，獲得了廣泛的關(guān)注。電化學(xué)分析中計(jì)時(shí)電流方法已在商業(yè)產(chǎn)品中得到成功應(yīng)用。例如，基于計(jì)時(shí)電流法的電化學(xué)酶傳感器已經(jīng)成功用于便攜式血糖儀的研制，具有操作簡單、成本低等的優(yōu)點(diǎn)[9-10]。在此基礎(chǔ)上，近年來免疫電化學(xué)分析方法也得到了廣泛關(guān)注[11-15]。免疫電化學(xué)的方法就是將電化學(xué)分析檢測與免疫學(xué)特異性分析方法相結(jié)合的一種生物傳感檢測方法，以電化學(xué)原理實(shí)現(xiàn)對免疫反應(yīng)形成的抗原-抗體復(fù)合物的特異性檢測[16-17]。

絲網(wǎng)印刷電極（screen printed electrode，SPE）具有制備簡單、易于批量生產(chǎn)、低成本、便攜和一次性使用等優(yōu)點(diǎn)，與傳統(tǒng)電化學(xué)分析方法相比，絲網(wǎng)印刷電極將工作電極、參比電極、輔助電極高度集成，解決了以往三電極體系分散、不易操作以及表面無法更新等問題。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與制備了可直接插入多孔板中進(jìn)行測量的小型絲網(wǎng)印刷電極，提高操作的方便性，并以克侖特羅為檢測目標(biāo)，建立了基于96孔酶標(biāo)板酶聯(lián)免疫反應(yīng)的微型絲網(wǎng)印刷電極快速檢測方法。本方法對豬肉和豬尿中克侖特羅進(jìn)行了測定，結(jié)果與ELISA試劑盒檢測結(jié)果一致，為現(xiàn)場檢測克侖特羅殘留的方法提供了新的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉購自南京某農(nóng)貿(mào)市場；豬尿取自南京某養(yǎng)豬廠；微型絲網(wǎng)印刷電極（工作電極和輔助電極為碳漿印制，參比電極為銀/氯化銀漿印制） 南京祥中生物科技有限公司。

克侖特羅抗原標(biāo)準(zhǔn)品 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；克侖特羅包被抗原和抗體、克侖特羅ELISA檢測試劑盒 南京祥中生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 北京博奧森生物公司；3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺生工生物工程（上海）股份有限公司；過氧化氫尿素（CO(NH2)·H2O2） 天津希恩思生物公司；硫酸、甲醇、濃鹽酸、氯化鈉（分析純） 南京化學(xué)試劑公司；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水（電阻率＞18.3 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-82恒溫箱 常州智博瑞儀器公司；洗板機(jī)美國BioTek公司；CHI123B電化學(xué)分析儀 上海辰華生物有限公司；VORTEX-5振蕩器 海門市其林貝爾儀器有限公司；TG16-WS離心機(jī) 上海盧湘儀器公司；BS124 S電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；酶標(biāo)儀（450 nm/630 nm） 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 SPE的制備

采用聚丙烯塑膠紙印刷絲網(wǎng)電極，每支電極尺寸規(guī)格：0.4 mm×7 mm×30 mm?；赘鶕?jù)自行設(shè)計(jì)的電極結(jié)構(gòu)圖（如圖1），第1層（圖1a）印制銀漿作為導(dǎo)電介質(zhì)，第2層（圖1b）印制碳作為工作電極和輔助電極，第3層（圖1c）印制銀/氯化銀漿作為參比電極。每印完一層漿料，在100 ℃條件下固化30 min。最后印制絕緣漿作為絕緣層（圖1d），100 ℃條件下烘干1 h后，通過各層漿料的疊加，制得微型絲網(wǎng)印刷電極（圖1e）。

圖1e中的1、2、3號接口分別與對電極導(dǎo)線、工作電極導(dǎo)線和參比電極導(dǎo)線連接，最后將3根導(dǎo)并與電化學(xué)工作站接通，電化學(xué)站則通過連有USB接口的導(dǎo)線與電腦相連。

圖1 絲網(wǎng)印刷電極印制過程Fig.1 Schematic illustration of SPE fabrication

1.3.2 微型絲網(wǎng)印刷電極的裝置及其檢測

基于96孔酶標(biāo)板免疫反應(yīng)，微型絲網(wǎng)印刷電極檢測的流程示意圖如圖2所示。整個(gè)流程裝置包括微型印刷電極（工作電極、輔助電極和參比電極）、96孔酶標(biāo)板以及便攜式電化學(xué)分析儀。本實(shí)驗(yàn)的電化學(xué)分析原理如圖3所示。首先，克侖特羅抗原標(biāo)準(zhǔn)品與包被在酶標(biāo)板上的克侖特羅抗原競爭結(jié)合克侖特羅抗體，經(jīng)過洗滌多孔板后，保留連接在酶標(biāo)板上的抗原-抗體復(fù)合物。隨后，向孔板中加入HRP酶標(biāo)二抗，二抗與酶標(biāo)板上抗原-抗體復(fù)合物反應(yīng)，最后加入酶底物H2O2和TMB發(fā)生酶催化反應(yīng)，產(chǎn)生電活性物質(zhì)TMB（ox），加H2SO4終止酶反應(yīng)。通過插入96孔酶標(biāo)板中的微型印刷絲網(wǎng)電極，實(shí)現(xiàn)對電活性產(chǎn)物TMB（ox）[20-22]的計(jì)時(shí)電流檢測。酶反應(yīng)方程式和電信號產(chǎn)生的還原反應(yīng)式如下。

酶催化反應(yīng)：

圖2 實(shí)驗(yàn)檢測裝置示意圖Fig.2 Schematic illustration of an analytical system for detecting clenbuterol

圖3 電化學(xué)免疫傳感方法示意圖Fig.3 Scheme illustration of electrochemical immunosensing method

1.3.3 酶標(biāo)板包被克侖特羅抗原

采用CB包被液（0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖溶液，pH 9.6）將克侖特羅包被抗原稀釋至1/8 000 倍，包被酶標(biāo)板，100 μL/孔，4 ℃冰箱過夜（12 h以上）；使用洗板機(jī)（洗滌液：0.1 mol/L磷酸鹽-0.05%吐溫）將含包被液的酶標(biāo)板清洗3 次，在吸水紙上拍干，向拍干的各孔加入封閉液（1% BSA，磷酸鹽配制）封閉，120 μL/孔，37 ℃溫育2.0 h[18-19]。

1.3.4 間接競爭免疫反應(yīng)

將克侖特羅抗原標(biāo)準(zhǔn)品原液倍比稀釋后加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，加入量為50 μL/孔；再將1/8 000倍稀釋的克侖特羅單克隆抗體加入到酶標(biāo)板孔內(nèi)（50 μL/孔），混勻，37 ℃溫育。

1.3.5 抗體與酶標(biāo)二抗反應(yīng)

使用洗板機(jī)將含抗原抗體反應(yīng)混合物的酶標(biāo)板清洗3 次，拍干后加入1/10 000倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠酶標(biāo)二抗（100 μL/孔），混勻，37 ℃溫育。

1.3.6 酶促反應(yīng)及酶反應(yīng)的終止

使用洗板機(jī)將含有酶標(biāo)二抗的酶標(biāo)板清洗3 次，拍干后加入A液（1 mmol/L H2O2）和B液（6 mmol/L TMB）各50 μL/孔，混勻，37 ℃溫育。溫育后，加入2 mol/L H2SO4，50 μL/孔，混勻。

1.3.7 電化學(xué)檢測

將微型絲網(wǎng)印刷電極插入已終止反應(yīng)的酶標(biāo)板微孔中，采用計(jì)時(shí)電流法（電壓：-0.1 V；時(shí)間：100 s）檢測終止反應(yīng)后產(chǎn)生TMB（ox）的還原峰電流值。

1.3.8 豬肉和豬尿樣品的前處理方法

1.3.8.1 豬肉樣品

稱?。?.00±0.05）g豬肉糜樣品至10 mL聚苯乙烯離心管中，加入3 mL 4% NaCl-0.05 mol/L HCl-99.9%甲醇混合液，用振蕩器振蕩提取5 min，6 660×g以上離心5 min，取50 μL上清液用于分析（樣品稀釋倍數(shù)為4 倍）。

1.3.8.2 豬尿樣品

取50 μL清亮尿樣按照標(biāo)準(zhǔn)品測定方法進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 溫育時(shí)間對峰電流響應(yīng)值的影響

圖4 間接免疫反應(yīng)的溫育時(shí)間（A）、酶標(biāo)二抗與抗體反應(yīng)的溫育時(shí)間（B）和酶反應(yīng)的溫育時(shí)間（C）對電流響應(yīng)值的影響Fig.4 Effect of incubation time for indirect competitive reaction (A), the reaction between HRP-goat anti-mouse IgG and antibody (B), and enzymatic reaction (C) on current value

首先考察了競爭反應(yīng)溫育時(shí)間對計(jì)時(shí)電流響應(yīng)值的影響，結(jié)果見圖4A，可看出，隨著競爭反應(yīng)溫育時(shí)間的延長，電流響應(yīng)值也相應(yīng)增加；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)30 min之后，電流響應(yīng)值的增加幅度逐漸減小。酶標(biāo)二抗與抗體反應(yīng)的溫育時(shí)間對計(jì)時(shí)電流響應(yīng)值的影響參見圖4B，考慮到快速檢測的需要，在滿足一定的線性范圍與檢測限要求的前提下，盡量縮短溫育時(shí)間，并參考ELISA檢測方法溫育時(shí)間的選擇，實(shí)驗(yàn)中選取30 min分別作為競爭反應(yīng)的溫育時(shí)間以及二抗與抗體反應(yīng)的溫育時(shí)間。底物與酶反應(yīng)的溫育時(shí)間對計(jì)時(shí)電流響應(yīng)值的結(jié)果見圖4C。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到15 min時(shí)，電流響應(yīng)增速達(dá)到最大，綜合考慮反應(yīng)時(shí)間的需要，實(shí)驗(yàn)選取選15 min作為底物與酶的溫育時(shí)間。

2.1.2 酶底物濃度的選擇

2.1.2.1 H2O2濃度對峰電流響應(yīng)值的影響

圖5 H2O2濃度與電流響應(yīng)值關(guān)系圖Fig.5 H2O2concentration vs. current value curve

采用1.3.1～1.3.7節(jié)的實(shí)驗(yàn)步驟及2.1.1節(jié)已優(yōu)化的各步反應(yīng)的溫育時(shí)間，B液濃度為1 mmol/L，H2O2濃度對酶產(chǎn)物TMB（ox）產(chǎn)生的電流值信號的影響結(jié)果見圖5?？芍?～3 mmol/L之間酶產(chǎn)物TMB（ox）產(chǎn)生的還原電流信號隨著H2O2濃度的增加而增加，在3～9 mmol/L之間，產(chǎn)生的還原電流值基本保持不變。這是因?yàn)楫?dāng)酶與底物B液濃度一定時(shí)，起初隨底物H2O2濃度的增加，酶產(chǎn)物TMB（ox）產(chǎn)生的量增加，產(chǎn)生的還原電流的信號值也增加，但當(dāng)H2O2達(dá)到一定濃度后，酶產(chǎn)物的量不再增加，產(chǎn)生的還原電流信號也基本保持不變。如果電信號基本保持不變后，繼續(xù)增加H2O2濃度，反而會(huì)抑制酶反應(yīng)，使電流信號值降低（圖中未標(biāo)出）。這是由于H2O2濃度存在一定的最佳值范圍，超過此范圍時(shí)，H2O2表現(xiàn)出一定的底物抑制效應(yīng)，因?yàn)楦邼舛菻2O2可能與酶形成死端復(fù)合物，從而抑制酶對TMB的催化[23]。所以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果選擇6 mmol/L作為酶反應(yīng)的最佳H2O2濃度。

2.1.2.2 TMB濃度對峰電流響應(yīng)值的影響

采用1.3.1～1.3.5節(jié)的實(shí)驗(yàn)步驟及2.1.1節(jié)已優(yōu)化的各步反應(yīng)的溫育時(shí)間，A液選擇優(yōu)化濃度6 mmol/L，考察了TMB濃度在0～2 mmol/L范圍內(nèi)對酶產(chǎn)物TMB（ox）產(chǎn)生的電流值信號的影響，結(jié)果見圖6。在0～0.9 mmol/L之間，產(chǎn)生的電流值隨TMB濃度的增加而增加，但超過0.9 mmol/L以后，電流值基本不變。這是因?yàn)槊负虷2O2的濃度是固定的，所以當(dāng)TMB達(dá)到一定濃度時(shí)，酶產(chǎn)物TMB（ox）的量也基本不變，產(chǎn)生的還原信號也基本不變。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選1 mmol/L作為酶底物TMB的最佳濃度。

圖6 TMB濃度與電流響應(yīng)值關(guān)系圖Fig.6 TMB concentration vs. current value curve

2.2 自制電極的重復(fù)性考察

從制備的電極條中隨機(jī)抽取10片微型絲網(wǎng)印刷電極，采用相同的實(shí)驗(yàn)條件，在1 mmol/L鐵氰化鉀（含0.1 mol/L氯化鉀）溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安測定，以圖譜峰高作為測定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所測定的不同電極間的峰電流相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%（圖略），表明所用電極的一致性較好，可用于實(shí)驗(yàn)測定。

2.3 克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測限的獲得

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，將克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)品1 000 μg/L原液倍比稀釋得到系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，獲得相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖7）。結(jié)果表明，克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度在0.025～2.0 μg/L范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度的半對數(shù)值與標(biāo)準(zhǔn)品的百分電流值比呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，其線性回歸方程為Y=30.114 46-35.901 56X（R2=0.998 5），X為克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度/的半對數(shù)值，Y為標(biāo)準(zhǔn)曲線百分電流值（I/I0×100，I為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液或樣本溶液的平均電流值，I0為0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均電流值）。

圖7 克侖特羅檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Calibration curve of clenbuterol

取10份克侖特羅空白樣品，測定得到峰電流響應(yīng)值I1、I2、I3…I10，代入克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=30.114 46-35.901 56X（R2=0.998 5），計(jì)算得到10份空白樣品含克侖特羅的質(zhì)量濃度（μg/L）ρ1、ρ2、ρ3…ρ10，檢測限的計(jì)算公式為LOD=+3s（為ρ1、ρ2、ρ3…ρ10的平均值，s為ρ1、ρ2、ρ3…ρ10的標(biāo)準(zhǔn)偏差），通過測量計(jì)算得檢測限為0.021 μg/L。

2.4 交叉反應(yīng)率的研究

由于酒石酸托特羅定、鹽酸環(huán)侖特羅、鹽酸氯丙那林、鹽酸妥洛特羅、沙丁胺醇、硫酸特布他林、富馬酸福莫特羅、班布特羅、萊克多巴胺可能與克侖特羅的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，對克侖特羅測定產(chǎn)生干擾，所以將上述9種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品配制成10 μg/L，分別與克侖特羅抗體競爭包被的克侖特羅抗原，同時(shí)與克侖特羅空白樣品的檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，得到各物質(zhì)的交叉反應(yīng)率，結(jié)果見圖8。鹽酸環(huán)侖特羅的交叉反應(yīng)率約為8%，其他各物質(zhì)的交叉反應(yīng)率均小于1%。

圖8 克侖特羅與其各種類似物質(zhì)的交叉反應(yīng)率Fig.8 Cross-reactivity of clenbuterol with other analogues

2.5 豬肉和豬尿中的克侖特羅殘留量的檢測

分別取適量的豬肉和豬尿克侖特羅陰性樣品進(jìn)行樣品前處理后，各檢測10份陰性樣品，得到峰電流響應(yīng)值I1、I2、I3…I10，檢測限的計(jì)算方法同2.3節(jié)，得豬肉和豬尿檢測限分別為0.18 μg/L和0.05 μg/L。所購克侖特羅ELISA檢測試劑盒對豬肉和豬尿的檢測限分別為1.00 μg/L和0.50 μg/L。向豬肉陰性樣品中加入克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)品，得到分別含1.00、2.00、4.00 μg/L的克侖特羅豬肉樣品，檢測過程同1.3.1～1.3.5節(jié)的實(shí)驗(yàn)步驟，測定加標(biāo)回收率，見表1。同樣，豬尿陰性樣品中加入克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)品，得到分別含0.30、0.80、1.00 μg/L的克侖特羅豬尿樣品，測定加標(biāo)回收率，見表2。

表1 豬肉中克侖特羅加標(biāo)回收率的測定Table 1 Recovery of clenbuterol from spiked pork

表2 豬尿中克侖特羅加標(biāo)回收率的測定Table 2 Recovery of clenbuterol from spiked swine urine

所購克侖特羅ELISA檢測試劑盒，標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度在0.05～1.35 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系（r=0.992 5），線性方程為Y=0.117 08-0.625 19X。應(yīng)用ELISA方法對克侖特羅加標(biāo)回收率進(jìn)行測定，當(dāng)豬肉陰性樣品中加入1.00 μg/L克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，實(shí)際檢測值為（0.99±0.03）μg/L，回收率為（99.13±2.98）%。豬尿陰性樣品中加入0.30、0.80、1.00 μg/L克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)品，測定加標(biāo)回收率，見表3。

表3 ELISA法測定豬尿中克侖特羅加標(biāo)回收率Table 3 Recovery of clenbuterol from spiked swine urine by ELISA

分別取適量經(jīng)過前處理的豬肉和豬尿樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果為：豬肉中克侖特羅含0.228 μg/L，豬尿中克侖特羅含0.06 μg/L，都符合國家標(biāo)準(zhǔn)（動(dòng)物性食品中克侖特羅檢出量要小于1 μg/L），認(rèn)為是陰性樣品，與克侖特羅的ELISA試劑盒檢測結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

將微型絲網(wǎng)印刷電極與96孔酶標(biāo)板組成微型生物電化學(xué)檢測裝置，通過間接競爭免疫反應(yīng)，最后采用電化學(xué)檢測手段來測定動(dòng)物性食品中克侖特羅的殘留量，該方法特異性高、簡單、成本低，裝置微型化、便于攜帶，為現(xiàn)場檢測克侖特羅的方法提供了 一種新的測定方法。

[1] 吳笑馳, 羅勇. 克倫特羅的藥理作用、濫用危害及其倫理思 考[J].醫(yī)學(xué)與哲學(xué)(A), 2012, 33(9): 42-78.

[2] 翟福麗, 賴克強(qiáng), 張衍亮, 等. 動(dòng)物性食品中β-興奮劑殘留概述[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(5): 351-356.

[3] LIU Baomi, YAN Hongyuan, QIAO Fengxia, et al. Determination of clenbuterol in porcine tissues using solid-p hase extraction combined with ultrasound-assisted dispersiv e liquid-liquid microextraction and HPLCUV detection[J]. Jo urnal of Chromatography B-Analytical Technologies in the B iomedical and Life Sciences, 2011, 879(1): 90-94.

[4] 甘平勝, 朱惠揚(yáng), 于鴻, 等. GC-MS法測定動(dòng)物性食品中15 種興奮劑殘留量[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 20 12, 22(11): 2544-2545.

[5] 張慧嫦, 張少恩, 吳忠華, 等. 膠體金免疫層析法快速檢測鹽酸 克倫特羅殘留[J]. 中國國境衛(wèi)生檢疫雜志, 2008, 31(1): 39-42.

[6] 姜 金慶, 楊雪峰, 王自良, 等. 克倫特羅和萊克多巴胺多殘留膠體金免疫層析試紙條的研制[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2013, 44(1): 87-94.

[7] REN Xianfu, ZHANG Fumei, CHEN Faju et al. Development of a sensitive monoclonal antibody-based ELISA for the detection of clenbuterol in animal tissues[J]. Food and Agricultural Immunology, 2009, 20(4): 333-344.

[8] 周群標(biāo), 桑亞新, 王麗, 等. 動(dòng)物性食品中鹽酸克倫特羅ELISA檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2011, 11(6): 158-162.

[9] 陳真誠, 趙于前. 一種便攜式酶電極血糖儀的研究[J]. 中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào), 2006, 25(2): 129-132.

[10] 于楊春, 王曉浩, 周兆英, 等. 酶電極法血糖儀的研制[J]. 儀器儀表學(xué)報(bào), 2003, 24(4): 289-290.

[11] PEMBERTON R M, PITTSON R, BIDDLE N, et al. Studies towards the development of a screen-printed carbon electrochemical immunosensor array for mycotoxins: a sensor for aflatoxin B-1[J]. Analytical Letters, 2006, 39(8): 1573-1586.

[12] LIU Gang, CHEN Haode, PENG Hongzhen, et al. A carbon nanotubebased high-sensit ivity electrochemical immunosensor for rapid and portable detection of clenbuterol[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2011, 28(1): 308-313.

[13] 姚冰, 劉曉芳, 柴春彥, 等. 生物傳感法檢測食品中的觸酶陽性菌[J].食品科學(xué), 2010, 31(14): 174-177.

[14] EISSA S, TLILI C, L’HOCINE L, et al. Electrochemical immunosensor for the milk allergen beta-lactoglobulin based on electrografting of organic film on gra phene modified screen-printed carbon elect rodes[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2012, 38(1): 308-313.

[15] LI Zongyun, WANG Yonghong, KONG Weijun, et al. Highly sensitive near-simultaneous assay of multiple “l(fā)ean meat agent” residues in swine urine using a disposable electrochemiluminescent immunosensors array[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2013, 39(1): 311- 314.

[16] YI Jian, MENG Meng, LIU Zhongqiu, et al. Development of an electrochemical immunoassay for detection of gatifloxacin in swine urine[J]. Journal of Zhejiang University-Science B, 2012, 13(2): 118-125.

[17] JIAO Kui, SUN Wei. Electrochemical studies of o-t ilidine as a hydrogen donor substrate for peroxidase and its application in enzyme immunoassay[J]. Microchemical Journal, 2002, 72(2): 123-130.

[18] 賀鐵明. 食品中殘留克倫特羅酶免疫檢測的研究[D]. 無錫: 江南大學(xué), 2004.

[19] 王帥兵, 左偉勇, 洪偉鳴, 等. 豬尿和豬肝中克倫特羅ELISA方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(1): 2 79-282.

[20] VOLPE G, COMPAGNONE D, DRAISCI R, et al. 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine as electrochemical substrate for horseradish peroxidase based enzyme immunoassays. A comparative study[J]. Analyst, 19 98, 123(6): 1303-1307.

[21] HE Yanan, CHEN Hongyuan, ZHENG Jinjuan, et al. Differential pulse voltammetric enzyme-linked immunoassay for the determination of Helicobacter pylori specific immunoglobulin G (IgG) antibody[J]. Talanta, 1997, 44(5): 823-830.

[22] FANJUL-BOLADO P, GONZALEZ-GARIA M B, COSTA-GARCIA A. Amperometric detection in TMB/HRP-based assays[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2005, 382(2): 297-302.

[23] 高孟姣, 應(yīng)太林, 漆德瑤. 辣根過氧化氫酶電極的研究[J]. 分析試驗(yàn)室, 2001, 20(1): 55-57.

On-site Electrochemical Detection of Clenbuterol Based on Mini-Screen Printed Electrodes

LIANG Hua1, SONG Wei2, XU Dan-ke2, LIU Ying3, ZHONG Wen-ying1,*
(1. School of Science, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China; 2. School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University, Nanjing 210093, China; 3. Nanjing Xiang Zhong Biotechnology Co. Ltd., Nanjing 210022, China)

An electrochemical sensing method for the detection of clenbuterol (CLB) was developed based on miniscreen printed electrodes and 96-well microtiter plate. Clenbuterol residues were indirectly detected by combined use of indirect competitive immunoreaction and chronoamperometry. The immune reaction and enzymatic reaction conditions were investigated. Under the optimized conditions, the results showed that the electrochemical immunosensor produced a linear range of 0.025–2.0 μg/L with a correlation coeff i cient of 0.999 2. The analytical results of CLB residues in pork and swine urine samples were consistent with those obtained with an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) plate. The detection limits for pork and swine urine samples were 0.18 μg/L and 0.05 μg/L, respectively, showing a decrease of one order of magnitude in comparison with those of ELISA.

mini-screen printed electrode; clenbuterol; chronoamperometry; electrochemical immunosensor

TS207.3

A

1002-6630（2014）08-0099-06

10.7506/spkx1002-6630-201408019

2013-08-07

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）項(xiàng)目（2011CB911003）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（21175066；21227009）；江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（BE2011773）；江蘇省環(huán)境監(jiān)測科研基金項(xiàng)目（1116）；國家創(chuàng)新研究群體科學(xué)基金項(xiàng)目（21121091）

梁樺（1987—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)殡娀瘜W(xué)傳感器。E-mail：lianghua257@aliyun.com

*通信作者：鐘文英（1968—），女，教授，博士，研究方向?yàn)閮x器分析。E-mail：wyzhong@cpu.edu.cn