HPLC法同時(shí)測(cè)定甘草中18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量Δ

陳 瑩，趙 博，喬 佳，張 慧（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600）

甘草酸是從豆科植物甘草中提取的一種三萜皂苷，是甘草中最重要的有效成分之一[1]。甘草酸具有兩種構(gòu)型，分別是18α-甘草酸（甘草酸二銨）和18β-甘草酸（甘草酸單銨），二者互為反向異構(gòu)體，在甘草中同時(shí)存在。18α-甘草酸和18β-甘草酸均具有抗炎、保肝、抗纖維化、抗腫瘤等藥理作用[2-4]，由二者制成的片劑、注射劑在臨床上廣泛應(yīng)用[5-6]。目前多見采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定甘草中18β-甘草酸含量的報(bào)道[7-9]，尚未見測(cè)定甘草中18α-甘草酸含量及方法的報(bào)道。為了更好地掌控甘草藥材的質(zhì)量，筆者采用HPLC法在同一色譜條件下同時(shí)測(cè)定甘草中18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量，試驗(yàn)結(jié)果可為不同商品規(guī)格甘草藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-10A型HPLC系統(tǒng)，包含紫外檢測(cè)器、LC solution 色譜工作站等（日本島津公司）；CP225D型電子分析天平（德國Sartorius 公司）；KQ5200DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

18α-甘草酸、18β-甘草酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：101050-201101、110731-201116，含量均≥98.0%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為哇哈哈純凈水。

1.3 藥材

市售10 個(gè)不同商品規(guī)格的甘草藥材，均經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、脹果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）的干燥根和根莖，詳見表1。

表1 不同商品規(guī)格樣品的商家和來源Tab 1 Manufacturers and sources of samples with different specifications

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ecosil-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸鹽緩沖液（80 ∶20，V/V，pH 7）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長：250 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取18α-甘草酸、18β-甘草酸對(duì)照品各適量，置于同一25 ml 量瓶中，加70%乙醇溶解并定容，制成18α-甘草酸、18β-甘草酸的質(zhì)量濃度均為0.2 mg/ml的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取甘草藥材粉末（過三號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇100 ml，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液10 μl，注入HPLC儀，記錄色譜，詳見圖1。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果表明，理論板數(shù)以18β-甘草酸峰計(jì)算為4 400，分離度＞1.5。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；1.18β-甘草酸；2.18α-甘草酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test samples；1.18β-glycyrrhizic acid；2.18αglycyrrhizic acid

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取18α-甘草酸對(duì)照品10.14 mg、18β-甘草酸對(duì)照品10.28 mg，分別置于同一10 ml量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。精密量取上述貯備液0.03、0.5、1.0、1.5、3.0 ml，分別置于10 ml 量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成系列溶液，分別取10 μl 注入HPLC 儀，記錄色譜。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得18α-甘草酸和18β-甘草酸回歸方程y＝4×106x+6 876.1（r＝0.999 9）、y＝4×106x+2 650.4（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，18α-甘草酸、18β-甘草酸檢測(cè)質(zhì)量濃度分別在3.042～304.2、3.084～308.4 μg/ml范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄各色譜峰面積。結(jié)果，18α-甘草酸、18β-甘草酸的RSD分別為0.86%、0.92%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一商品規(guī)格甘草藥材粉末（沈陽成大方圓藥店）適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，放置0、2、4、6、8 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄各色譜峰面積。結(jié)果，18α-甘草酸、18β-甘草酸的RSD分別為0.63%、0.82%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)質(zhì)量穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一商品規(guī)格甘草藥材粉末（沈陽成大方圓藥店）適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄各色譜峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果，含18α-甘草酸、18β-甘草酸的量分別為0.91%、4.38%，RSD分別為0.75%、1.02%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取0.1 g 已知含量的甘草藥材粉末（沈陽成大方圓藥店），共6 份，分別精密加入18α-甘草酸、18β-甘草酸對(duì)照品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test（n＝6）

2.9 樣品含量測(cè)定

取10 個(gè)商品規(guī)格甘草藥材粉末各3 份，精密稱定，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（%，，n＝3）Tab 3 Results of content determination of samples（%，，n＝3）

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（%，，n＝3）Tab 3 Results of content determination of samples（%，，n＝3）

-：表示未檢出-：means no detected

3 討論

3.1 檢測(cè)波長的確定

精密稱取18α-甘草酸、18β-甘草酸對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解，分別制成每1 ml約含30 μg的溶液，在200～400 nm波長范圍掃描。結(jié)果顯示，二者均在（250±2）nm波長處有最大吸收，因此選擇250 nm作為含量測(cè)定的檢測(cè)波長。

3.2 流動(dòng)相的確定

筆者曾采用0.05%磷酸溶液-乙腈梯度洗脫的方法[10]，結(jié)果所需洗脫時(shí)間較長；還曾采用甲醇-0.2 mol/L醋酸銨-冰醋酸為流動(dòng)相[7-8]，結(jié)果主峰未與雜質(zhì)峰分離。最終，確定本試驗(yàn)的流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸鹽緩沖液（80 ∶20，V/V，pH 7）。在此條件下洗脫時(shí)間短，且主峰與雜質(zhì)峰分離度良好。

3.3 樣品提取方法的確定

根據(jù)18α-甘草酸和18β-甘草酸的溶解性，筆者曾嘗試用甲醇、70%乙醇、水進(jìn)行提取，結(jié)果70%乙醇的提取效果最好。筆者還曾嘗試采用回流提取法和超聲提取法等不同提取方法，結(jié)果超聲提取法的提取率較高；同時(shí)，亦比較了超聲20、30、45 min的提取效果，結(jié)果超聲提取30 min時(shí)18α-甘草酸和18β-甘草酸就已提取完全。

3.4 含量測(cè)定結(jié)果的分析

含量測(cè)定結(jié)果顯示，甘草藥材中18β-甘草酸含量最高者可達(dá)6.30%，而18α-甘草酸含量最高者僅為0.93%，且有部分樣品甚至未檢出，可見甘草藥材中18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量差異較大，18β-甘草酸的含量遠(yuǎn)高于18α-甘草酸。正因?yàn)?8β-甘草酸在甘草中的含量較高，因而受到研究者的廣泛關(guān)注，對(duì)另一有效成分18α-甘草酸的研究卻往往被忽視。

文獻(xiàn)[7-9，11-12]曾報(bào)道，采用HPLC 法以甲醇-0.2 mol/L 醋酸銨-冰醋酸、乙腈-0.1 mol/L磷酸溶液為流動(dòng)相測(cè)定甘草中18β-甘草酸含量，以乙腈-2%冰醋酸、甲醇-冰醋酸-水（三乙胺調(diào)pH至4.35）為流動(dòng)相測(cè)定甘草制劑中18β-甘草酸含量的方法，但未見對(duì)甘草中另一活性成分18α-甘草酸含量測(cè)定方法的研究報(bào)道，特別是在同一流動(dòng)相條件下同時(shí)檢測(cè)具有藥理活性且為同分異構(gòu)體的上述兩種專屬性成分的研究報(bào)道。

綜上所述，本方法準(zhǔn)確、可靠、簡單、快速，可用于不同商品規(guī)格甘草藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

[1]趙祎鐳，師清芝，唐星.甘草中甘草酸和甘草苷的提取純化工藝研究[J].中國藥房，2009，20（6）：426.

[2]鄭艷，胡漢昆.甘草次酸與甘草酸二銨抗炎護(hù)肝作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國藥師，2012，15（5）：604.

[3]歐強(qiáng)，陳良，譚德明，等.甘草酸二銨抗大鼠免疫性肝纖維化作用研究[J].中成藥，2006，28（7）：1 046.

[4]劉軍花，魏華波，姚瑛，等.四種不同甘草有效成分的抗腫瘤血管新生作用[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10（14）：2 731.

[5]董大勇.異甘草酸鎂治療慢性乙型肝炎的臨床觀察[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2010，14（19）：68.

[6]陳凱紅，蔣祥虎，蒲云川，等.甘草酸二銨治療慢性乙型肝炎患者的細(xì)胞免疫功能變化[J].中華傳染病雜志，2006，24（5）：348.

[7]徐樹蕓，王海寧.HPLC測(cè)定甘草提取物中甘草酸的含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（24）：10 297.

[8]張崇禧，楊春花，蔡恩博，等.HPLC分析甘草中甘草酸和甘草苷含量[J].資源開發(fā)與市場，2010，26（8）：673.

[9]牛小宇，劉春生，崔浩然.栽培甘草群體中不同單株甘草酸的含量差異研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20（9）：2 121.

[10]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：80.

[11]曾英彤，黃志軍，李澤華.HPLC 法測(cè)定復(fù)方甘草片中甘草酸含量[J].中國藥師，2009，12（11）：1 584.

[12]李浩，劉燕，張少文.高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方甘草合劑中甘草酸含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2004，24（5）：314.