海洋放線菌Y18的分子鑒定、生物活性及其抗菌物質(zhì)發(fā)酵條件優(yōu)化

苑孟 俞勇 李會(huì)榮 董寧 張曉華

（1中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東青島266003；2國(guó)家海洋局極地科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)極地研究中心，上海200136）

0 引言

放線菌是非常重要的生物活性物質(zhì)來(lái)源，目前為止大約三分之二的天然抗生素分離自放線菌［1］，且絕大多數(shù)來(lái)自于鏈霉菌屬和小單孢菌屬。近年來(lái)，人們?cè)诤Y選活性物質(zhì)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)從陸地來(lái)源放線菌中獲取新型天然活性物質(zhì)的幾率越來(lái)越小，于是，人們開(kāi)始探索其他生境來(lái)源的放線菌，希望從中篩選出新型生物活性物質(zhì)。海洋占地球表面積的70%以上，它的高鹽、高壓、寡營(yíng)養(yǎng)的特點(diǎn)，使海洋放線菌進(jìn)化出來(lái)與陸地放線菌所不同的代謝途徑，可能產(chǎn)生大量的新穎的生物活性物質(zhì)［2］。近年來(lái)，人們從海洋環(huán)境中分離出大量不同種類的放線菌［3］，同時(shí)，也從這些海洋放線菌中發(fā)現(xiàn)了許多結(jié)構(gòu)新穎的生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物［4-5］。北冰洋氣候寒冷，水溫大部分時(shí)間在0℃以下，環(huán)境十分惡劣，面對(duì)如此極端環(huán)境，放線菌必須產(chǎn)生與之相適應(yīng)的生理生化特征及代謝途徑。因而北冰洋的放線菌可能會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎，生物活性特殊的生物活性物質(zhì)。

菌株Y18是一株分離自北冰洋楚科奇海沉積物具有較高抗菌活性的稀有放線菌，其良好生長(zhǎng)需要海水。本文對(duì)該菌株的分子鑒定、抗菌活性、活性物質(zhì)發(fā)酵條件及其發(fā)酵產(chǎn)物的穩(wěn)定性進(jìn)行了初步研究，為Y18菌株的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源

放線菌Y18分離自2010年中國(guó)第4次北極科學(xué)考察隊(duì)采集于北冰洋楚科奇海的海洋沉積物（70°45.60′N，164°43.70′W；水深 26m）。

供試菌株：金黃葡萄球菌（Staphylococcus aureus），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），大腸桿菌（Escherichia coli），銅綠 假 單胞菌 （Pseudomonas aeruginosa）以及白色念珠菌（Candida albicans），由中國(guó)極地研究中心微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

ISPⅡ培養(yǎng)基［6］（用于 Y18的基本培養(yǎng)）：酵母浸出粉4 g，麥芽浸出物10 g，葡萄糖4 g，瓊脂15 g，無(wú)菌楚科奇海海水（天然海水，鹽度3%）1 L，pH 7.0；

PM3培養(yǎng)基［7］（用于 Y18的固體發(fā)酵）：燕麥粉20 g，甘油 2.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 mg，MnCl2·4H2O 0.1 mg，ZnSO4·7H2O 0.1 mg，瓊脂 15 g，無(wú)菌天然海水1 L；

沙氏培養(yǎng)基（用于供試菌白色念珠菌的培養(yǎng)）：蛋白胨 10 g，葡萄糖 40 g，瓊脂 15 g，無(wú)菌水1 L，pH 5.6；

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（用于供試菌枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃葡萄球菌的培養(yǎng)）：牛肉膏 1 g，酵母膏 2 g，蛋白胨 5 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，無(wú)菌水 1 L；

LB培養(yǎng)基（用于DH5α感受態(tài)培養(yǎng)）：胰蛋白胨 10 g，酵母膏 5 g，NaCl 10 g，瓊脂 15 g，無(wú)菌水1 L；

發(fā)酵培養(yǎng)基［7-11］：M1（大豆粉 20 g，蛋白胨 2 g，葡萄糖 20 g，淀粉 5 g，酵母膏 2 g，海水 1 L pH 7.5）；M2（淀粉 10 g，蔗糖 10 g，黃豆粉 6 g，MgSO40.5 g，海水1 L）；M3（蛋白胨 2 g，酪素水解物 2 g，酵母膏2 g，葡萄糖1 g，海水1 L）；M4（蔗糖20 g，黃豆粉15 g，酵母膏 1.5 g，甘油 2 g，海水 1 L）；M5（PM3液體）（燕麥粉20 g，甘油2.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1mg，MnCl2·4H2O 0.1mg，ZnSO4·7H2O 0.1mg，海水1 L）。

1.2 菌株分子鑒定

Y18基因組DNA的提取采用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）。用細(xì)菌 16SrDNA通用引物［12］27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R （5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μl：模板 DNA 2μl，10×buffer 5μl，BSA（1 mg／ml）4μl，dNTP（2.5mM）1μl，引物（10μM）各 1μl，Taq DNA聚合酶3.5U。擴(kuò)增程序?yàn)? min at 94℃預(yù)變性 6 min，94℃變性 45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸8 min。取兩次PCR后產(chǎn)物100μl用Genclean瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司），進(jìn)行16S rDNA的回收純化，純化后的DNA片段用TaKaRa（大連寶生物工程有限公司）的 pMD18-T Vector試劑盒進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞（天根生化科技有限公司，北京），于含有100μg／ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色菌落用T載體通用引物M13＋、M13-進(jìn)行菌落PCR，獲得陽(yáng)性克隆，送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序，并提交GenBank注冊(cè)。將所測(cè)序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast相似性比較，選取與選定菌株親緣關(guān)系較近的菌株用 Mega4軟件［13］采用鄰接法（neighbor-joining method）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

1.3 需海水及耐鹽性試驗(yàn)

挑取Y18單菌落分別點(diǎn)種在ISPⅡ天然海水培養(yǎng)基、ISPⅡ人工海水培養(yǎng)基（3%的海鹽，Sigma）、及含有0%、3%、6%、10%、15%NaCl的 ISPⅡ去離子水培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1—4周，觀察菌落的生長(zhǎng)情況。

1.4 抗菌活性研究

1.4.1 次級(jí)代謝產(chǎn)物合成酶基因的篩選

次級(jí)代謝產(chǎn)物合成酶基因的引物［14-17］：PKSⅠ：KSMA-F（5′-TSGCSATGGACCCSCAGCAG-3′），KSMBR（5′-CCSGTSCCGTGSGCCTCSAC-3′）；PKSⅡ：540F（5′-GGITGCACSTCIGGIMTSGAC-3′），1100R（5′-CC-GATSGCICCSAGIGAGTG-3′）；NRPS：A3F（5′-GCSTACSYSATSTACACSTCSGG-3′），A7R（5′-SASGTCVCCSGTSCGGTAS-3′）；CYP：PEH-1（5′-TGGATCGGCGACGACCGSVYCGT-3′），PEH-2（5′-CCGWASAGSAYSCCGTCGTACTT-3′）。引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。四種基因的PCR反應(yīng)體系都為50μl，擴(kuò)增條件分別按照文獻(xiàn)7、文獻(xiàn)15、文獻(xiàn)16、文獻(xiàn)17進(jìn)行。取5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電壓為120 V。

1.4.2 抗菌活性檢測(cè)

將Y18的單菌落接種于PM3固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一周以上，將含有菌的直徑8 mm的瓊脂塊轉(zhuǎn)移到涂有100μl供試菌枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的培養(yǎng)基上，28℃，16 h后觀察抑菌圈。以不含菌的瓊脂塊作為對(duì)照。

1.5 Y18發(fā)酵條件的研究

挑取Y18單菌落接種于5 ml ISPⅡ天然海水培養(yǎng)基中，180 rpm，28℃條件下培養(yǎng)5天，按1%的接種量接到100 ml ISPⅡ海水培養(yǎng)基中，加入10顆左右玻璃珠，180 rpm，28℃條件下培養(yǎng)6天作為種子液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

對(duì)Y18抗菌物質(zhì)發(fā)酵條件進(jìn)行了初步研究，分別測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、種子液接種量、培養(yǎng)基的初始pH值、培養(yǎng)基的裝液量對(duì)發(fā)酵液抗菌活性的影響，從而選擇合適的發(fā)酵條件。采用牛津杯法通過(guò)測(cè)定抑菌圈大小來(lái)判斷其對(duì)枯草芽孢桿菌的抗菌活性，以高溫滅活的發(fā)酵液作為對(duì)照。每組試驗(yàn)設(shè)三個(gè)重復(fù)。

1.6 發(fā)酵液的穩(wěn)定性試驗(yàn)

菌株Y18在優(yōu)化后的條件下發(fā)酵，發(fā)酵液進(jìn)行室溫和低溫貯藏穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)重復(fù)。

1.6.1 發(fā)酵液貯藏穩(wěn)定性測(cè)試

取發(fā)酵液30 ml分成兩份，分別放置在室溫和4℃冰箱中保存，在保存的第1、3、5、7、15、30天使用牛津杯方法檢測(cè)其抑菌活性，與初始的抑菌活性做比較。以高溫失活的發(fā)酵液作為對(duì)照。

1.6.2 發(fā)酵液熱穩(wěn)定性測(cè)試

取發(fā)酵上清液分裝到2 ml離心管中，每管1 ml，分別置于 50℃、60℃、70℃、80℃、100℃、121℃中處理30分鐘，冷卻到室溫后，以未處理的發(fā)酵液做對(duì)照，采用牛津杯法檢測(cè)其抗菌活性的變化。

1.6.3 發(fā)酵液酸堿穩(wěn)定性測(cè)試

取發(fā)酵上清液分裝到5 ml離心管中，每管3 ml，用 1 mol／L的 HCl或 1 mol／L的 NaOH溶液將pH分別調(diào)至 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，室溫放置2小時(shí)后，將 pH調(diào)回初始 pH，以相同條件處理的高溫失活發(fā)酵液和未處理的發(fā)酵液做對(duì)照，采用牛津杯法檢測(cè)其抗菌活性的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 Y18菌株的分子鑒定

將菌株Y18的16S rDNA基因片段進(jìn)行克隆測(cè)序后，獲得1 491 bp的16S rDNA序列，提交Gen-Bank注冊(cè)后，獲得登錄號(hào) KF306354。將序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast比對(duì)后，選取與Y18相近的模式菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）。結(jié)果表明菌株Y18歸屬于擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis），與模式菌株 Nocardiopsis dassonvillei subsp.dassonvillei DSM 43111T同屬一個(gè)進(jìn)化分支，其相似度高達(dá)99.8%，1 491個(gè)堿基中只有3個(gè)堿基的差異。因此，將該菌株暫命名為Nocardiopsis sp.Y18。

2.2 需海水及耐鹽性

Y18在ISPⅡ海水培養(yǎng)基（SW）和ISPⅡ人工海水培養(yǎng)基（ASW）上生長(zhǎng)良好；在含有0%和6%NaCl的培養(yǎng)基中可以生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度較慢，且氣生菌絲體與生長(zhǎng)良好狀態(tài)下相比不夠發(fā)達(dá)。在10%、15%NaCl的ISPⅡ去離子水培養(yǎng)基的平板上不能生長(zhǎng)。

2.3 生物活性研究結(jié)果

對(duì)Y18的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成酶基因及抗菌活性篩選結(jié)果見(jiàn)表1。從結(jié)果可以看出Y18含有兩種次級(jí)代謝產(chǎn)物合成酶基因：PKSⅡ和NRPS；可以抑制枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的生長(zhǎng)，其抑菌圈大小分別為：20mm和15 mm，這說(shuō)明Y18具有較好的抗菌活性。

圖1 根據(jù)16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1.Neighbor-joining tree based on 16S rDNA gene sequences showing bootstrap values（1 000 replications）.Bar：0.02 substitutions per nucleotide position

表1 次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因和抗菌活性篩選Table 1.Biosynthetic genes and antimicrobial activities

2.4 Y18發(fā)酵條件研究結(jié)果

2.4.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇結(jié)果

將Y18按1%的接種量接到選定的5種培養(yǎng)基中，28℃，180 rpm的條件下發(fā)酵6天，用牛津杯法檢測(cè)各自的抑菌活性。M1、M2、M4、M5都沒(méi)有檢測(cè)出抑菌活性，M3號(hào)培養(yǎng)基的抑菌圈直徑平均為18 mm，因此選用M3號(hào)培養(yǎng)基作為Y18的發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.4.2 發(fā)酵時(shí)間及種子液接種量的確定

將種子液分別按1%、4%和8%的接種量接于100 ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，每天同一時(shí)間檢測(cè)抑菌活性（圖2）。可以看出1%接種量的抗菌活性較低，4%和8%接種量都在第六天表現(xiàn)出了最大的抑菌活性，抑菌圈直徑達(dá)到22.5 mm。第六天之后抗菌活性開(kāi)始下降，因此將發(fā)酵天數(shù)定為6天。8%接種量雖然表現(xiàn)出抗菌活性的時(shí)間比較早，但第六天后其抑菌活性下降較快，因此將種子液的接種量定為4%。

圖2 不同接種量及不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響Fig.2.Effect of inoculation dose and fermentation time on antibiotic activity

2.4.3 培養(yǎng)基裝液量的確定

用1 000 ml的錐形瓶分別測(cè)定 20%、30%40%、50%裝液量的抑菌活性，將種子液以4%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，180 rpm的條件下發(fā)酵6天。結(jié)果表明20%裝液量的抑菌活性較好，抑菌圈直徑平均為23 mm，30%裝液量的抑菌圈直徑平均為16 mm，40%的裝液量抑菌效果較差，為13 mm，50%的裝液量幾乎沒(méi)有抑菌效果，因此將1 000 m l錐形瓶的裝液量定為20%。

2.4.4 發(fā)酵溫度的確定

將種子液以4%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別置于15℃、28℃、37℃培養(yǎng)6天，發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)酵溫度為28℃時(shí)，抑菌效果最好，抑菌圈直徑平均為21 mm；當(dāng)發(fā)酵溫度為15℃時(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢，代謝產(chǎn)物量很少，沒(méi)有觀察到抑菌圈；當(dāng)發(fā)酵溫度為37℃時(shí)，抑菌效果比較差，抑菌圈直徑僅為12 mm。因此確定發(fā)酵溫度為28℃。

2.4.5 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值的確定

分別將發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)至6.0、7.0、8.0和9.0，培養(yǎng)7天后檢測(cè)其抑菌效果得到圖3?？梢钥闯龀跏紁H在7—8之間時(shí)，發(fā)酵液的抑菌效果都比較好，當(dāng)初始pH值為8.0時(shí)，效果最好，抑菌圈直徑平均為20.5 mm。因此將初始pH值定為8.0。

圖3 發(fā)酵液初始pH值對(duì)菌株抑菌活性的影響Fig.3.Effect of initial pH value on antibiotic activity

2.5 發(fā)酵液穩(wěn)定性研究結(jié)果

2.5.1 發(fā)酵液貯藏穩(wěn)定性

發(fā)酵液的隨時(shí)間變化的抗菌活性如圖4所示，可以看出發(fā)酵液在4℃中貯藏更有利于維持高的抗菌活性。在貯藏的第30天，4℃的活性僅下降了10%，而室溫條件下貯藏活性下降了38%，因此該菌株產(chǎn)生的活性物質(zhì)在低溫儲(chǔ)藏效果較好。

圖4 不同貯藏條件對(duì)菌株抗菌活性的影響Fig.4.Effect of different storage conditions on antibiotic activity

2.5.2 發(fā)酵液酸堿穩(wěn)定性

發(fā)酵液酸堿穩(wěn)定性如圖5所示，以相同pH條件處理的高溫失活發(fā)酵液無(wú)抗菌活性。從圖中可以看出發(fā)酵液在堿性條件下有較好的抑菌活性，在pH11的強(qiáng)堿環(huán)境下仍保持對(duì)照發(fā)酵液的94%的活性。在酸性條件下抑菌活性也較高，在pH3的強(qiáng)酸條件下其抑菌活性為對(duì)照的92%。因此可以看出Y18菌株發(fā)酵液有較寬的酸堿適合范圍，在pH8—9條件下活性最好，隨著pH升高或降低，其抑菌活性均有下降，所以在對(duì)Y18菌株處理時(shí)，盡量控制pH值，減少抑菌活性物質(zhì)的損失。

圖5 pH對(duì)抗菌活性的影響Fig.5.Stability of fermentation liquid against different pH

2.5.3 發(fā)酵液熱穩(wěn)定性

由圖6可以看出Y18發(fā)酵液具有較高的熱穩(wěn)定性，在50℃中處理30 min，其抑菌活性沒(méi)有變化；發(fā)酵液在80℃中處理30 min后，抑菌活性為對(duì)照的80%，下降了20%；在100℃和121℃處理30 min后，發(fā)酵液?jiǎn)适Я丝咕钚?。該結(jié)果說(shuō)明，發(fā)酵液在低于80℃時(shí)，熱穩(wěn)定性較好，但高于80℃熱穩(wěn)定性下降較快。

圖6 溫度對(duì)抑菌活性的影響Fig.6.Stability of fermentation liquid against different temperature

3 討論

北冰洋氣候寒冷，水溫大部分時(shí)間在0℃以下，2／3的洋面常年被海冰覆蓋，因此其海洋環(huán)境樣品采集相對(duì)困難，涉及北冰洋海洋放線菌的研究工作也相對(duì)較少。近幾年來(lái)隨著對(duì)海洋及極端環(huán)境微生物的關(guān)注度的提升，研究工作取得了很大的進(jìn)展。2007年Bredholt等［7］從挪威海特隆赫姆峽灣力道3 200多株海洋放線菌，除了鏈霉菌屬和小單孢菌屬外還有很多的稀有放線菌，且分離到的鏈霉菌中有80%的菌株具有抗菌活性。俞勇等［18］從楚科奇海和加拿大海盆分離到61株放線菌，其中的28株菌分別屬于迪茨氏菌屬、紅球菌屬等6個(gè)屬。上述結(jié)果表明北冰洋放線菌物種多樣性豐富，是微生物資源的重要新來(lái)源。同時(shí)，面對(duì)嚴(yán)酷的環(huán)境條件，放線菌必須進(jìn)化出相應(yīng)的生理、生化特征才能在其中生存。挪威海特隆赫姆峽灣海洋放線菌的研究證明了這一點(diǎn)。2010年，J?rgensen等從峽灣的450 m水深海底沉積物中分離到的一株鏈霉菌中分得一個(gè)大環(huán)內(nèi)脂酰胺類化合物，該化合物對(duì)白色念珠菌、光滑念珠菌和藤黃微球菌都有抑制作用［19］。Engelhardt等從峽灣24.6 m水深的海洋沉積物來(lái)源的擬諾卡氏菌菌株中發(fā)現(xiàn)一個(gè)含硫多肽類化合物，可以抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的生長(zhǎng)［20］。本文對(duì)一株來(lái)自北冰洋楚科奇海海洋沉積物的海洋放線菌Y18進(jìn)行了一系列的研究，包括其分類鑒定、抗菌活性，并對(duì)其活性物質(zhì)的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)也研究了其發(fā)酵液的穩(wěn)定性。

通過(guò)16S rDNA序列分析，發(fā)現(xiàn)與其親緣關(guān)系最近的種為Nocardiopsis dassonvillei subsp.dassonvillei DSM 43111T，相似性高達(dá)99.8%。其NaCl耐受范圍為0%—6%，對(duì)鹽度的耐受范圍比較廣泛。該菌株可以在不含鹽的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但其在海水培養(yǎng)基中生長(zhǎng)得更好，因此，該菌株可能是由陸地進(jìn)入海洋并已開(kāi)始適應(yīng)海洋環(huán)境。

海洋微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物主要以聚酮類化合物和非核糖體肽類化合物為主，負(fù)責(zé)合成這兩類化合物的酶分別屬于多聚酮合酶（Polyketidesynthetase，PKS）和非核糖體肽合成酶（Non-ribosomal peptide synthetase，NRPS）［16］。聚酮類化合物又分為芳香環(huán)聚酮類化合物（四環(huán)素、阿霉素）和大環(huán)內(nèi)酯類化合物（雷帕霉素、阿維霉素），分別由PKSⅡ和PKSⅠ途徑合成。細(xì)胞色素P450羥化酶基因（CYP）可以合成多烯類物質(zhì)，對(duì)真菌有抑制效果［21］。從基因篩選的結(jié)果看該菌株可能會(huì)產(chǎn)芳香環(huán)聚酮類化合物和非核糖體肽類化合物。抗菌活性篩選的結(jié)果為該菌株可以抑制枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的生長(zhǎng)，尤其對(duì)枯草芽孢桿菌有很好的抑制作用，因此有較高的研究?jī)r(jià)值。

本研究表明，適合Y18發(fā)酵產(chǎn)抗芽孢桿菌活性產(chǎn)物的培養(yǎng)基配方為：蛋白胨2 g，酪素水解物2 g，酵母膏2 g，葡萄糖1 g，海水1 L；發(fā)酵條件為：發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值8.0，種子液接種量4%，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時(shí)間6天，1 000 mL三角瓶裝液量20%。經(jīng)優(yōu)化后該菌株發(fā)酵液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑從最初的18 mm上升到了25 mm，在發(fā)酵條件優(yōu)化后抗菌活性大大提高，抑菌圈直徑增加了38.9%。

對(duì)發(fā)酵液的穩(wěn)定性研究表明，發(fā)酵液對(duì)溫度具有較好的穩(wěn)定性，對(duì)酸堿環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)，低溫貯藏性較好。這為Y18菌株發(fā)酵液抗菌活性成分進(jìn)一步分離純化提供了理論依據(jù)，為該菌株進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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