5種葡萄球菌腸毒素基因MPCR-DHPLC檢測方法的建立

陳 彬，鄭 晶，王 穎，黃曉蓉，林 杰，彭華毅，邵碧英,*

（1.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建 福州 350001；2.福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350001；3.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

5種葡萄球菌腸毒素基因MPCR-DHPLC檢測方法的建立

陳 彬1,2，鄭 晶1,2，王 穎1,3，黃曉蓉1,2，林 杰1,2，彭華毅1,2，邵碧英1,2,*

（1.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建 福州 350001；2.福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350001；3.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

設(shè)計(jì)合成5 種葡萄球菌腸毒素基因（SEA、SEB、SEC、SED、SEE）的特異性引物，對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化后，建立5 種葡萄球菌腸毒素基因的多重PCR結(jié)合變性高效液相色譜（multiplex PCR-denaturing high performance liquid chromatography，MPCR-DHPLC）檢測方法，并進(jìn)行MPCR-DHPLC檢測特異性及靈敏度的測定，5重PCR-DHPLC檢測靈敏度可達(dá)到100 CFU/mL。MPCR-DHPLC方法應(yīng)用于食品中金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測，具有快速、準(zhǔn)確、高通量等優(yōu)點(diǎn)。

金黃色葡萄球菌；腸毒素；多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；變性高效液相色譜

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA），是引起細(xì)菌性食物中毒的重要病原菌之一[1]，其中引起中毒的致病因子是葡萄球菌腸毒素（staphylococcal enterotoxins，SEs）。根據(jù)其血清學(xué)特性，SEs可分為5 種分別是SEA、SEB、SEC、SED、SEE。目前檢測SES的方法按照檢測原理不同，分為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、免疫血清學(xué)方法、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)、生物傳感器等[2-4]。其中PCR技術(shù)具有快速、靈敏等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于致病菌的檢測，多重PCR（multiplex PCR，MPCR）是對PCR技術(shù)的改進(jìn)而建立起來的一種體外擴(kuò)增技術(shù)，具有擴(kuò)增效率高、經(jīng)濟(jì)簡便等特點(diǎn)，在臨床診斷上具有獨(dú)特的優(yōu)勢和極高的應(yīng)用價(jià)值[5-7]，也特別適合食品中致病微生物的快速測定[8-10]，在葡萄球菌腸毒素檢測上已有一些報(bào)道[11-13]。但多采用凝膠電泳法檢測PCR產(chǎn)物，步驟繁瑣，易造成污染。變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）是新進(jìn)發(fā)展的新技術(shù)，由PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)DHPLC技術(shù)進(jìn)行快速檢測，該技術(shù)已在致病微生物檢測上得到應(yīng)用[14-19]，但在葡萄球菌腸毒素檢測上未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選取金黃色葡萄球菌5 種腸毒素基因，擬建立5 種腸毒素基因的MPCR-DHPLC檢測方法，分析食品中金黃色葡萄球菌腸毒素基因型分布情況，并用于食品中金黃色葡萄球菌腸毒素快速、高通量檢測。

1 材料與方法

1.1 菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株5 株，分別是產(chǎn)SEA的金黃色葡萄球菌（ICQQ22024）、產(chǎn)SEC的金黃色葡萄球菌（ICQQ22028）、產(chǎn)SED的金黃色葡萄球菌（ICQQ22003） 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院；產(chǎn)SEB的金黃色葡萄球菌（F0137）和產(chǎn)SEE的金黃色葡萄球菌（T43）由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、腸炎沙門氏菌（ATCC 13076） 上海漢尼公司。

1.2 試劑與儀器

2×Taq PCR Master Mix、dNTP、DNA MarkerⅠ、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、多重PCR擴(kuò)增試劑盒北京天根生化科技有限公司；三乙基銨乙酸鹽緩沖溶液（three ethyl ammonium acetate buffer solution，TEAA）、DNA標(biāo)樣 北京市表觀生物技術(shù)有限公司。

Tgradient 96梯度PCR儀 德國Biometra公司；PTC 220 PCR儀 美國Bio-Rad公司；WAVE4500變性高效液相色譜儀 美國Transgenomic公司；Biophotometer核酸蛋白儀 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 引物

根據(jù)基因序列數(shù)據(jù)庫（GenBank）上查找5 種葡萄球菌腸毒素（SEA、SEB、SEC、SED、SEE）基因和特異基因femA的序列，并在美國生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上進(jìn)行序列比對后篩選各自的特異性擴(kuò)增片段，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，委托上海生工公司合成以下引物（表1）。引物用TE溶液（pH 8.0）稀釋至濃度為10 μmol/L，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實(shí)驗(yàn)引物Table 1 The primer pairs used for experiments

1.3.2 細(xì)菌DNA的提取

各取5 株金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株凍干粉，分別溶解于7.5%氯化鈉肉湯中，于（36 ±1）℃培養(yǎng)18～24 h，將培養(yǎng)物劃線接種到Baird-Parker平板，（36±1） ℃培養(yǎng)18～24 h。挑取平板上典型單菌落接種到5 mL 腦心浸液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）培養(yǎng)液中，在臺(tái)式恒溫振蕩器（36±1）℃振蕩培養(yǎng)12 h。取50株非金黃色葡萄球菌的甘油保存液100 ?L，接種于4 mL營養(yǎng)肉湯，（36±1） ℃培養(yǎng)18～24 h。各取1 mL菌懸液，按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取DNA，經(jīng)1∶10稀釋后，于核酸蛋白儀上測定濃度和純度，并用（Tris+EDTA，TE）溶液（pH 8.0）稀釋至50 ng/?L，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 5 種葡萄球菌腸毒素基因多重PCR反應(yīng)體系的確立

檢測5 種葡萄球菌腸毒素基因中的2 種和3 種各有10個(gè)組合，4 種的有5 個(gè)組合，2、3、4重和5重PCR反應(yīng)總體積均為20 ?L，6重PCR反應(yīng)總體積均為30 ?L。

1.3.3.1 2重PCR反應(yīng)體系

10×Multi HotSart Buffer 2 μL，Super Pure dNTP 1.6 μL，Multi HotSart DNA Polymerase 0.4 μL，相應(yīng)的DNA模板各1 μL（50 ng），各引物和ddH2O的用量如表2所示。

表2 2重PCR反應(yīng)體系中引物和ddH O的用量Table 2 The amounts of ddH O and primers used in duplex PCR reaction system

1.3.3.2 3重和4重PCR反應(yīng)體系

表3 3重PCR反應(yīng)體系中引物和ddH O的用量Table 3 The amounts of ddH O and primers used in triplex PCRreaction system

表4 4重PCR反應(yīng)體系中引物和ddH2OO的用量Table 4 The amounts of ddH2OO and primers used in quadruplex PCR reaction system

10×Multi HotSart Buffer 3 μL，Super Pure dNTP 2.4 μL，Multi HotSart DNA Polymerase 0.6 μL，相應(yīng)的DNA模板各1 μL（50 ng），各引物和ddH2O的用量如表3、4所示。

1.3.3.3 5重PCR反應(yīng)體系

10×Multi HotSart Buffer 4 μL，Super Pure dNTP 3.2 μL，Multi HotSart DNA Polymerase 0.8 μL，相應(yīng)的DNA模板各1 μL （50ng），SEA-F、SEA-R各0.5 μL，SEB-F、SEB-R各0.8 μL，SEC-F、SEC-R各0.5 μL，SED-F、SED-R各1.0 μL，SEE-F、SEE-R各0.5 μL，ddH2O 0.4 μL。

1.3.3.4 6重PCR反應(yīng)體系

10×Multi HotSart Buffer 4 ?L，Super Pure dNTP 3.2，Multi HotSart DNA Polymerase 0.8 ?L，相應(yīng)的DNA模板各1 ?L（50 ng），SEA-F、SEA-R各0.5 ?L，SEB-F、SEB-R各0.8 ?L，SEC-F、SEC-R各0.5 ?L，SED-F、SED-R各1.0 ?L，SEE-F、SEE-R各0.5 ?L，femA-F、femA-R各0.5 ?L，ddH2O 9.4 ?L。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火90 s，72 ℃延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，以確定各引物所加的比例是否合適。

1.3.4 MPCR-DHPLC方法的建立

取上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行DHPLC檢測，上樣量5 μL，洗脫液由緩沖液A（0.1 mmol/L的TEAA）和緩沖液B（0.1 mmol/L的TEAA，含25%乙腈）組成，以0.9 mL/min的流速在50 ℃條件下自動(dòng)洗脫DNA分子，運(yùn)行時(shí)間為20 min，用峰對應(yīng)的堿基對大小來判斷PCR產(chǎn)物是否正確。

1.3.5 MPCR-DHPLC檢測特異性的測定

為了驗(yàn)證該方法的特異性，以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA作為陽性對照，以ddH2O作為空白對照，并以50株非金黃色葡萄球菌的細(xì)菌的DNA作為陰性對照，進(jìn)行MPCR擴(kuò)增并用DHPLC觀察結(jié)果。

1.3.6 MPCR-DHPLC檢測靈敏度的測定

5 種金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株制成菌懸液后分別1∶10系列稀釋，選擇合適的稀釋度進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，同時(shí)按1.3.2節(jié)中方法提取DNA模板，并按照1.3.3節(jié)的反應(yīng)條件進(jìn)行MPCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，取5 ?L MPCR產(chǎn)物進(jìn)行DHPLC檢測。

1.3.7 MPCR-DHPLC方法的應(yīng)用

將建立的MPCR-DHPLC檢測方法用于本實(shí)驗(yàn)室近年來從食品樣品中分離的80 株金黃色葡萄球菌的檢測。吸取甘油保存的金黃色葡萄球菌菌液50 ?L于BHI培養(yǎng)，（36±1）℃搖床培養(yǎng)12 h。吸取1 mL菌懸液，12 000 r/min離心2 min，棄上清液。若沉淀太少，再取1 mL菌懸液進(jìn)行離心操作。用試劑盒法提取DNA，進(jìn)行MPCR-DHPLC檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 5 種葡萄球菌腸毒素基因多重PCR反應(yīng)體系的建立

圖1 PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of duplex and triplex PCR products

圖2 4、5、6 重PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of quadruplex, quintuplex and sextuplex PCR products

圖3 MPCR-瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果Fig.3 Agarose electrophoresis showing the validity of MPCR

實(shí)驗(yàn)建立的多重PCR反應(yīng)體系均能很好地?cái)U(kuò)增出相應(yīng)的腸毒素基因。選用多重PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行MPCR擴(kuò)增，5 種腸毒素及femA基因的2～6 重PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1、2所示，各產(chǎn)物對應(yīng)的條帶清晰，且無雜帶產(chǎn)生，表明經(jīng)過多層優(yōu)化，確立的引物比例合適，互不干擾，為DHPLC檢測做好基礎(chǔ)。為了觀察6對引物同時(shí)擴(kuò)增的效果，實(shí)驗(yàn)采用5 種葡萄球菌腸毒素產(chǎn)毒株的DNA

模板進(jìn)行擴(kuò)增，從1、2重逐級擴(kuò)增到6重，瓊脂糖凝膠法觀察的結(jié)果如圖3所示，MPCR產(chǎn)物中僅擴(kuò)增到與在PCR反應(yīng)體系中加入的模板DNA相對應(yīng)的條帶，沒有任何雜帶的出現(xiàn)，表明MPCR反應(yīng)體系具有很好的特異性。

2.2 MPCR-DHPLC方法的建立

圖4 MPCR-DHPLC驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 Verification of MPCR-DHPLC

DHPLC觀察的結(jié)果如圖4所示，5 種葡萄腸毒素及femA基因相對應(yīng)的陽性峰出現(xiàn)位置與預(yù)期吻合，各峰分離清晰，無雜峰產(chǎn)生，表明建立的MPCR-DHPLC檢測方法是可行的。

2.3 MPCR-DHPLC方法的特異性

用建立的MPCR-DHPLC法檢測本實(shí)驗(yàn)室保存的50 株非金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)株和分離株的特異性檢測，測定的結(jié)果只有金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株出現(xiàn)預(yù)期峰，而非目標(biāo)菌株均未出現(xiàn)任何峰。以大腸埃希氏菌、沙門氏菌測定結(jié)果為例如圖5所示，只有金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株擴(kuò)增出了相應(yīng)的目的條帶，而大腸埃希氏菌、沙門氏菌菌株以及ddH2O均沒有出現(xiàn)任何條帶。測定結(jié)果表明建立的MPCR-DHPLC方法的特異性很好。

圖5 5對引物特異性實(shí)驗(yàn)DHPLC觀察結(jié)果Fig.5 Specificity of MPCR-DHPLC

2.4 MPCR-DHPLC方法的靈敏度

圖6 MPCR-DHPLC靈敏度測定結(jié)果Fig.6 Sensitivity of MPCR-DHPLC

MPCR-DHPLC檢測靈敏度的測定結(jié)果如圖6所示，隨著菌含量的逐漸減少，DHPLC檢測結(jié)果顯示的特異峰面積越來越小。SEA最低能檢測到53 CFU/mL，SEB能檢測到36 CFU/mL，SEC能檢測到45 CFU/mL，SED能檢測到32 CFU/mL，SEE能檢測到41 CFU/mL。結(jié)果顯示，MPCR-DHPLC方法的靈敏度可達(dá)到100 CFU/mL。

2.5 MPCR-DHPLC檢測方法的實(shí)際應(yīng)用

將建立的MPCR-DHPLC方法用于本實(shí)驗(yàn)室近幾年從食品樣品中分離的金黃色葡萄球菌的檢測，共檢測了80 株金黃色葡萄球菌。檢測結(jié)果顯示，80 株金黃色葡萄球菌中有47 株攜帶腸毒素基因，其中33 株菌只攜帶一種腸毒素基因，13 株菌攜帶兩種腸毒素基因，1 株菌攜帶一種腸毒素基因。同時(shí)攜帶多種腸毒素基因的部分樣品采用MPCR-DHPLC方法的檢測結(jié)果見圖7。

圖7 MPCR-DHPLC方法檢測食品樣品中分離金葡菌菌株的結(jié)果Fig.7 Results of MPCR-DHPLC detection of S. aureus strains isolated from food samples

3 討 論

對于多重PCR反應(yīng)體系的建立，反應(yīng)條件的優(yōu)化非常重要，否則可能導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性、假陰性，拖帶、涂抹帶或非特異性條帶等結(jié)果。引物濃度比例、退火溫度等都影響多重PCR的成敗[20]。本實(shí)驗(yàn)不僅對各引物的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，也對熱啟動(dòng)DNA聚合酶和dNTP的用量進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)過多方面的優(yōu)化，最后確定了2～6 重PCR反應(yīng)體系中各引物和試劑的用量。最終確定了2～6 重PCR反應(yīng)體系的引物的量。有研究[21]表明，多重PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增片段的大小和所用引物濃度幾乎呈正相關(guān)，即片段大的，引物濃度高。而實(shí)驗(yàn)多次優(yōu)化確定的引物濃度結(jié)果同這條規(guī)律并非完全符合，因此建立一個(gè)新的MPCR反應(yīng)體系就要進(jìn)行實(shí)際的優(yōu)化過程。

作為高效快速的分子生物學(xué)手段，利用多重PCR體系對細(xì)菌目的基因進(jìn)行檢測和分型已獲得普遍認(rèn)可。在葡萄球菌腸毒素檢測上不僅快速、靈敏，而且不受葡萄球菌毒素抗體制備和毒素基因表達(dá)的限制[22-25]，彌補(bǔ)傳統(tǒng)免疫學(xué)檢測方法的不足，但PCR或MPCR產(chǎn)物均采用凝膠電泳的方法，目前尚未見將DHPLC方法應(yīng)用于葡萄球菌腸毒素檢測及分型的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)多重PCR體系是在單一PCR的基礎(chǔ)上，通過合理設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，使得在同一反應(yīng)管內(nèi)可同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因，既節(jié)省試劑，又提高檢測效率。PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)DHPLC技術(shù)進(jìn)行快速檢測，可同時(shí)對金黃色葡萄球菌的5種葡萄球菌腸毒素進(jìn)行檢測和分型。

傳統(tǒng)的檢測方法采用細(xì)菌分離培養(yǎng)方法，對金黃色葡萄球菌的檢測需要3～6 d，對檢出的金黃色葡萄球菌是否產(chǎn)腸毒素，耗時(shí)更長。本實(shí)驗(yàn)建立的MPCR-DHPLC檢測方法，從取樣、增菌、DNA提取到出具結(jié)果，只需要2 d時(shí)間，檢測靈敏度可達(dá)到100 CFU/mL，應(yīng)用于食品中金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測，具有快速、準(zhǔn)確、高通量的優(yōu)點(diǎn)。而且，本實(shí)驗(yàn)采用DHPLC方法代替瓊脂糖凝膠電泳，不僅可以省掉點(diǎn)樣、電泳、染色和觀察等較為繁瑣的步驟，還可以避免電泳易受到污染的情況。只需將PCR反應(yīng)管放入自動(dòng)進(jìn)樣器，設(shè)定好程序，便能自動(dòng)完成數(shù)百個(gè)樣品的檢測。因此，將建立的MPCR-DHPLC方法應(yīng)用于食品中金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測，不僅能大大縮短檢測周期，達(dá)到高通量檢測的目的，對預(yù)防和診斷由腸毒素引起的食物中毒具有很高的應(yīng)用價(jià)值。雖然目前對攜帶這些腸毒素基因型的葡萄球菌的毒性作用尚不明確，但是通過對食品污染監(jiān)測發(fā)現(xiàn)攜帶腸毒素基因的金葡菌時(shí)可及時(shí)進(jìn)行預(yù)警，另外在由腸毒素引起的食物中毒調(diào)查和溯源中有很好的應(yīng)用價(jià)值。

[1] NIKOLAY S, DMITRIY V S. Analysis of multiple staphylococcal enterotoxin genes by an oligonucleotide microarray assay[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2004, 42(5): 2134-2143.

[2] 向陽. 食品中金黃色葡萄球菌及其腸毒素的檢測方法[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2002, 2(2): 57-61.

[3] 李琳, 黃金海, 趙耘, 等. 葡萄球菌腸毒素基因分型PCR檢測技術(shù)的研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(7): 340-344.

[4] 劉鵬翀, 黃金海, 劉莉, 等. 葡萄球菌腸毒素DAS-ELISA檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(8): 195-198.

[5] BEATRICLE B, LAURENT P. Updated multiplex polymerase chain reaction for detection of 16S rRNA methylases: high prevalence among NDM-1 producers[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2011, 74(4): 442-445.

[6] LAURENT P, TIMOTHY R W. Multiplex PCR for detection of acquired carbapenemase genes[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2011, 70(1): 119-123.

[7] ROBIN B L, ANDERSSON L M. Seasonal variations of 15 respiratory agents illustrated by the application of a multiplex polymerase chain reaction assay[J]. Scandinacian Journal of Infectious Diseases, 2012, 44(1): 9-17.

[8] 安利偉, 陳蕊. 多重PCR技術(shù)在檢測食源性病原微生物中的應(yīng)用[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2010, 6(8): 172-173.

[9] 張小賢, 張家敏, 黃衛(wèi)平, 等. 應(yīng)用多重PCR法快速檢測傷寒沙門菌的研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2010, 20(5): 1074-1076.

[10] 張健, 鄧志愛, 劉巧宜, 等. 兩種方法檢測凍肉中的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2010, 20(3): 628-629; 632.

[11] 劉景武, 張偉. FTA濾膜用于PCR檢測肉中的金黃色葡萄球菌[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2005, 21(6): 1009-1013.

[12] 徐曉可, 吳清平, 張菊梅, 等. 食品中金黃色葡萄球菌多重PCR檢測方法的研究[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2011, 30(1): 84-89.

[13] 王麗, 王冰, 黎桂蓮, 等. 金黃色葡萄球菌腸毒素快速分型體系的建立及應(yīng)用[J]. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 33(2): 154-156; 159.

[14] HURTLE W, SHOEMAKER D, HENCHAL E, et a1. Denaturing HPLC for identifying bacteria[J]. Biotechniques, 2002, 33(2): 386-391.

[15] FRANCIOSA G, POURSHABAN M, LUCA A, et a1. Identification of type A, B, E and F botulinum neurotoxin genes and of botulinum neurotoxigenic clostridia by denaturing high-performance liquid chromatography[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(3): 4170-4176.

[16] 楊春華, 曹際娟, 鐘毅, 等. 乳及乳制品中肺炎克雷伯氏菌PCR-DHPLC檢測新技術(shù)的建立[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2010, 47(12): 1805-1810.

[17] 許龍巖, 劉靜宇, 袁慕云, 等. MPCR-DHPLC檢測大腸桿菌O157的研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2010, 20(5): 1057-1059.

[18] 曹際娟, 王耀, 王順之, 等. PCR-DHPLC技術(shù)快速檢測食品中英諾克李斯特氏菌[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2009, 32(2): 235-238.

[19] 陸連壽, 張秀英, 鄭明. 變性高效液相色譜檢測技術(shù)在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用[J]. 中國獸藥雜志, 2009, 43(9): 40-44.

[20] 劉志杰, 李如舉, 曾智勇, 等. 多重PCR反應(yīng)的影響因素及其優(yōu)化[J].黑龍江畜牧獸醫(yī), 2011, 54(13): 26-28.

[21] 謝芝勛, 謝志勤, 龐耀珊, 等. 應(yīng)用三重聚合酶鏈反應(yīng)同時(shí)檢測鑒別雞3 種病毒性呼吸道傳染病的研究[J]. 中國獸醫(yī)科技, 2001, 31(1): 11-14.

[22] OMOE K, ISHIKAWA M, SHIMODA Y, et a1. Detection of seg she, and seigenes in Staphylococcus aureus isolates and determination of the enterotoxin productivities of S. aureus isolates Harboring seg she, or seigenes[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2002, 40(3): 857-862.

[23] 邱陽, 王剛, 盧行安. PCR技術(shù)檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素B基因[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2004, 16(2): 115-116.

[24] 梁毅珊. 金黃色葡萄球菌腸毒素及其檢測方法的研究進(jìn)展[J]. 中國熱帶醫(yī)學(xué), 2008, 8(9): 1658-1659.

[25] 張嚴(yán)峻, 張俊彥, 梅玲玲, 等. 金黃色葡萄球菌腸毒素基因型分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2010, 20(6): 1417-1418.

Development of a Multiplex PCR-DHPLC Detection Method for Five Staphylococcal Enterotoxin Genes

CHEN Bin1,2, ZHENG Jing1,2, WANG Ying1,3, HUANG Xiao-rong1,2, LIN Jie1,2, PENG Hua-yi1,2, SHAO Bi-ying1,2,*
(1. Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001, China; 2. Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research, Fuzhou 350001, China; 3. College of Food Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

Primer pairs specific for the five staphylococcal enterotoxin genes SEA, SEB, SEC, SED, and SEE were designed and synthesized. Using multiplex polymerase chain reaction coupled with denaturing high performance liquid chromatograph (MPCR-DHPLC), a detection method for these five staphylococcal enterotoxin genes were established after the polymerase chain reaction (PCR) reaction conditions were optimized. The sensitivity and specificity of the detection method were then determined. The results showed that the quintuplex PCR-DHPLC method could detect specifically staphylococcal enterotoxin genes with detection limit of 100 CFU/mL. The MPCR-DHPLC method is useful for the rapid, accurate and high-throughput detection of staphylococcal enterotoxins in food samples.

Staphylococcus aureus; enterotoxin; MPCR; DHPLC

Q93.332

A

1002-6630（2014）24-0243-06

10.7506/spkx1002-6630-201424047

2014-06-30

福建省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012J01062）；福建局科技項(xiàng)目（FK2012-25）

陳彬（1969—），女，高級工程師，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称肺⑸餀z驗(yàn)。E-mail：chenbin0123@aliyun.com

*通信作者：邵碧英（1973—），女，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸餀z驗(yàn)。E-mail：byshao@sohu.com