Cry2A蛋白的石英晶體微天平檢測

杜 方，黃 新，紀(jì)淑娟,*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院植物檢疫研究所，北京 100029）

Cry2A蛋白的石英晶體微天平檢測

杜 方1，黃 新2，紀(jì)淑娟1,*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院植物檢疫研究所，北京 100029）

目的：建立檢測蘇云金芽孢桿菌Cry2A蛋白的石英晶體微天平（quartz crystal microbalance，QCM）傳感方法。方法：根據(jù)抗原抗體相互作用原理，利用QCM技術(shù)，在金片表面修飾抗原所對應(yīng)的單克隆抗體，對蘇云金芽孢桿菌Cry2A蛋白進行檢測研究。結(jié)果：該方法靈敏度達到1 μg/mL，特異性好、重復(fù)性高。結(jié)論：該方法有利于為蘇云金芽孢桿菌蛋白檢測提供新思路，可以應(yīng)用到實際樣品的檢測，在農(nóng)產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因檢測和進出口檢驗檢疫中具有很好的應(yīng)用前景。

石英晶體微天平；Cry2A蛋白；轉(zhuǎn)基因作物

轉(zhuǎn)基因技術(shù)憑借可以使作物育種定向化的自身優(yōu)勢，近年來得到了迅猛發(fā)展[1]。由蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）中的cry基因表達的抗蟲性轉(zhuǎn)基因作物成為主要抗蟲作物之一[2]。蘇云金芽孢桿菌是一種廣泛存在于土壤中的革蘭氏陽性菌，在芽孢形成時產(chǎn)生的具有高度特異性殺蟲活性的晶體蛋白，稱為殺蟲晶體蛋白（insecticidal crystal protein，ICPs），目前主要的Bt轉(zhuǎn)基因作物是棉花和玉米[3]。第1代Bt棉花是孟山都公司著名的Bollgard棉和Ingard棉，表達Cry1Ac毒素，有效控制了北美地區(qū)的重要害蟲[4-5]。孟山都公司開發(fā)的第2代Bt棉花BollgardⅡ棉可以同時表達Cry1Ac和Cry2Ab兩種Cry毒素。

Bt殺蟲蛋白基因現(xiàn)已成為轉(zhuǎn)基因作物育種研究中應(yīng)用最廣泛的抗蟲基因[3]。Cry2A殺蟲蛋白是由蘇云金芽孢桿菌形成芽孢時產(chǎn)生的殺蟲蛋白中的一類，對鱗翅目和雙翅目昆蟲具有特異殺蟲毒性。Cry2A基因與目前轉(zhuǎn)基因作物中常用的Cry1Ab基因的同源性小于45%，因此對于某些Cry1A殺蟲蛋白不能殺死的害蟲具有殺蟲效果。Bt轉(zhuǎn)基因水稻中的Cry2A基因是根據(jù)原始基因進行密碼子優(yōu)化得到的，在植物中能夠很好的表達[6]。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展的同時，轉(zhuǎn)基因作物的 生物安全問題備受關(guān)注。許多國家要求對轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品實行標(biāo)簽制度[7-10]。為了保證轉(zhuǎn)基因作物安全管理和標(biāo)識制度的順利實施，轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品檢測方法和技術(shù)體系的研究就顯得尤為關(guān)鍵。目前常用的檢測方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測[11]和酶聯(lián)免疫吸附法[12]，但是這兩種方法程序復(fù)雜，儀器設(shè)備要求高，耗時長，檢測成本高，并且需要專業(yè)的技術(shù)人員。本實驗研究了QCM傳感器檢測方法，通過壓電效應(yīng)來檢測晶體表面質(zhì)量的變化[13-17]。在金片表面特異性修飾Cry2A單克隆抗體，該方法檢測時間短，方法簡便易掌握，金片可以反復(fù)使用30 次以上，靈敏度高，特異性好，變異系數(shù)小，因此是一種有效可行的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

Cry2A轉(zhuǎn)基因水稻、Cry1Ac轉(zhuǎn)基因水稻、非轉(zhuǎn)基因水稻 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院；Cry2A蛋白及Cry2Ab單克隆抗體 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所；牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）上海游然傳感科技有限公司；N-羥基硫代琥珀酰亞胺（N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt，Sulfo-NHS）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、N-乙基-N’-（二甲氨基丙基）二亞胺（N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride，EDC） 美國Sigma公司；脂肪酸甲酯磺酸鹽（fatty acid methyl ester sulfonate，MES）、11-巰基十一酸（11-mercaptoundecanoic acid，11-MUA）、3-巰基丙酸（3-mercaptopropionic acid，3-MPA）、Tris-HCl（pH6.5） 上海共價化學(xué)科技有限公司；30%雙氧水和氨水 北京翰隆達科技發(fā)展有限公司；CP4-EPSPS蛋白抗原 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院；石英晶體微天平 美國Biolin Scientific AB公司。

1.2 方法

1.2.1 QCM金片預(yù)處理

將30%雙氧水、氨水、水按1∶1∶5的體積比煮沸，溫度為85 ℃，10 min后取出，用去離子水洗凈氮氣吹干，再用無水乙醇清洗，氮氣干燥備用。

1.2.2 QCM表面修飾

將預(yù)處理后的金片沉浸在濃度為10 mmol/L比例為10∶1的3-MPA與11-MUA混合液中，封口膜封好過夜，之后用去離子水和乙醇清洗表面，氮氣吹干后修飾現(xiàn)配的1∶1的EDC（0.075 mol/L）和NHS（0.015 mol/L）混合液，室溫2 h后重復(fù)此過程，用于活化金片表面11-MUA的硫醇羧基，洗凈吹干后滴加0.2 mg/mL的Cry2Ab單克隆抗體，抗體用PBS稀釋，在恒溫箱37 ℃靜置3 h（封口膜封好，并在周圍灑若干水），之后用去離子水洗凈殘留抗體，用PBS稀釋牛血清蛋白BSA到1 mg/mL，將BSA滴加金片表面封閉未結(jié)合羧基位點，室溫靜置2 h，水洗吹干－4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 樣品QCM檢測

將修飾好的金片固定于QCM傳感器中，打開蠕動泵開始流速為200 μL/min，樣品管通入PBS，等基線穩(wěn)定流速改為50 μL/min，通入待檢測抗原，PBS稀釋到目標(biāo)質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 QCM檢測Cry2A蛋白的靈敏度與重復(fù)性

2.1.1 靈敏度與線性相關(guān)性

為了考察QCM金片檢測Cry2A蛋白的靈敏度。將提純蛋白用PBS進行稀釋，分別稀釋為1、5、10、20、30 μg/mL，然后進行QCM檢測，當(dāng)進樣時間約20 min后，蠕動泵將抗原溶液送達金片表面，引起金片頻率下降和耗散上升，說明抗原與QCM金片表面固定的抗體特異性地結(jié)合在一起?？乖芤簶悠焚|(zhì)量濃度越大，與金片表面單抗結(jié)合的抗原越多，引起頻率下降越多。用3次響應(yīng)值的平均值與抗原質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，得到一條近似符合線性關(guān)系的的直線，R2為0.993 7，相關(guān)系數(shù)較好。將3次實驗數(shù)據(jù)取平均值作圖如圖2所示，由圖2可知，用QCM檢測Cry2A蛋白的靈敏度可以達到1 μg/mL，由表1可見，其3 次檢出限頻率下降分別為2.14、2.06、2.19 Hz。

圖1 QCM金片檢測Cry2A抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Cry2A antigen using QCM chip

圖2 QCM芯片檢測靈敏度Fig.2 Sensitivity and repeatability of Cry2A protein detection using QCM

表1 QCM金片的重復(fù)性Table 1 The repeatability of QCM chip

2.1.2 重復(fù)性

在同樣的條件下分別對15 片QCM金片進行清洗、修飾活化、固定單克隆抗體等過程，將固定好單抗的QCM金片用于檢測上述5 種質(zhì)量濃度的抗原，每個質(zhì)量濃度測量3 次，得到結(jié)果如表1所示，計算3 次測量值的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)。得到的變異系數(shù)均小于相應(yīng)平均值的10%，說明QCM金片檢測Cry2A蛋白的重復(fù)性較好。

2.2 QCM檢測Cry2A蛋白的特異性

為了考察QCM檢測Cry2A蛋白的特異性，同樣取1 mL質(zhì)量濃度為20 μg/mL的CP4-EPSPS蛋白、Cry2A蛋白和兩種蛋白等體積的混合液進行QCM檢測，重復(fù)實驗3次，如表2、圖3所示。檢測同樣質(zhì)量濃度的樣品溶液，只有含有Cry2A蛋白的抗原溶液有明顯的響應(yīng)。說明該方法修飾的金片具有良好的特異性。

表2 QCM金片特異性Table 2 The specificity of QCM chip

圖3 QCM檢測Cry2A蛋白特異性結(jié)果Fig.3 Specificity of QCM for Cry2A protein detection

2.3 實際樣品檢測

為了考察制備的QCM金片對轉(zhuǎn)基因水稻實際樣品的檢測效果和特異性，選擇Cry1Ac轉(zhuǎn)基因水稻、非轉(zhuǎn)基因水稻和Cry2A轉(zhuǎn)基因水稻種子，用液氮研磨成粉末，用PBS將水稻粉末稀釋同樣倍數(shù)，對3 種水稻實際樣品進行檢測，如圖4所示，只有Cry2A轉(zhuǎn)基因水稻信號明顯，另外兩種轉(zhuǎn)基因水稻信號很小，接近儀器誤差水平。說明該方法制備的QCM金片選擇性強，特異性好，可以應(yīng)用到實際樣品的檢測中去。

圖4 QCM金片轉(zhuǎn)基因水稻檢測結(jié)果Fig.4 Detection of genetically modified rice using QCM

3 結(jié) 論

由于目前轉(zhuǎn)基因食品安全性引起社會各界廣泛關(guān)注[18-19]，因此轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的研究有著重要的現(xiàn)實意義，根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，通過自組裝法制成檢測芯片[20-24]，利用QCM生物傳感器可以實現(xiàn)檢測過程方便快捷，結(jié)果真實可靠，檢測時間短，檢測靈敏度可達到1 μg/mL，檢測質(zhì)量濃度同為20 μg/mL的CP4-EPSPS和Cry2A蛋白作比較時發(fā)現(xiàn)，CP4-EPSPS蛋白幾乎沒有響應(yīng)，而Cry2A蛋白響應(yīng)明顯，在實際樣品檢測實驗中，Cry2A轉(zhuǎn)基因水稻頻率下降值明顯高于非轉(zhuǎn)基因水稻和Cry1Ac轉(zhuǎn)基因水稻，說明不僅該方法特異性很好，而且可以應(yīng)用到實際樣品檢測。實驗中的金片耗材價格為800 元人民幣，為了節(jié)約成本，實驗中的QCM金片經(jīng)過處理后，可以重復(fù)使用，每片金片可以重復(fù)利用30 次左右。此方法可以廣泛應(yīng)用到進出口植物檢驗檢疫工作中，對于轉(zhuǎn)基因檢測有著重要的應(yīng)用價值。

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Detection of Cry2A Protein Based on Quartz Crystal Microbalance Technique

DU Fang1, HUANG Xin2, JI Shu-juan1,*
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2. Institute of Plant Quarantine, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100029, China)

Purpose: To establish a detection method for Cry2A protein by quartz crystal microbalance (QCM) sensing method. Methods: By using QCM, based on the principle of the interaction between antigen and antibody, the specific monoclonal antibody was modifi ed on the gold surface for Cry2A protein detection. Results: The proposed method had a high sensitivity of 1 μg/mL, good specifi city, and suffi cient repeatability. Conclusion: This method may provide a new idea for the detection of Bacillus thuringiensis protein from genetically modifi ed crops and thus has promising prospects for application in import and export inspection and quarantine supervision work.

quartz crystal microbalance (QCM); Cry2A protein; genetically modifi ed crop (GMC)

Q31

A

1002-6630（2014）24-0209-04

10.7506/spkx1002-6630-201424040

2014-01-17

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項（201410014）

杜方（1987—），男，碩士研究生，研究方向為食品質(zhì)量控制。E-mail：dufang321@163.com

*通信作者：紀(jì)淑娟（1960—），女，教授，博士，研究方向為食品質(zhì)量控制。E-mail：1162212290@qq.com